烟草新型胱硫醚—γ—合成酶的检测与分析

罗岸

摘要：利用少量细胞分离技术和RT-PCR技术，在烟草合子中克隆到一种新型胱硫醚-γ-合成酶基因，命名为NtCGS-4。序列分析显示新基因开放性阅读框长度为1 611 bp，编码537个氨基酸，预测分子质量为57.931 2 ku，等电点为6.15。利用染色体步移技术获得该基因5′上游2 696 bp的侧翼序列（启动子和5′UTR）。系统进化分析表明，该基因与多种农作物的胱硫醚-γ-合成酶基因具有较高同源性。烟草新型胱硫醚-γ-合成酶NtCGS-4可能在烟草早期胚胎发生中参与甲硫氨酸的生物合成和代谢。

关键词：烟草；胱硫醚-γ-合成酶；基因克隆；甲硫氨酸；合子

中图分类号：S572；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2651-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.024

Detection and Analysis of a New Type of Cystathionine-γ-synthase in Nicotiana tabacum

LUO An

（College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434023， Hubei， China）

Abstract： By application of the reverse transcription PCR（RT-PCR） in small amount of cells，a new type cystathionine-γ-synthase （CGS） gene was found in tobacco zygote，named as NtCGS-4.The analysis showed that the CDS sequence of NtCGS-4 was 1 611 bp，encoding a polypeptide of 537 amino acid residues with a predicted molecular weight of 57.931 2 ku and the theoretical PI was 6.15. 2 696 bp sequence of the 5′ flanking region（promoter and 5′UTR） of NtCGS-4 was obtained by genome walking.The phylogenetic tree revealed that NtCGS-4 had a high homology with CGS gene from multiple crops. The new type cystathionine-γ-synthase（CGS） gene NtCGS-4 may be involved in the biosynthesis and metabolism of methionine in early embryogenesis of tobacco.

Key words： tobacco； cystathionine-γ-synthase； gene cloning； methionine； zygote

含有硫元素的甲硫氨酸属于人类和家畜的必需氨基酸之一，其含量与农作物的营养价值息息相关[1]。此外甲硫氨酸除了参与蛋白质组成和mRNA翻译起始外，还能通过一些代谢产物间接调控许多细胞生命活动，比如参与细胞分裂、细胞壁形成、叶绿体和细胞膜合成[2]，参与调控成熟和衰老等过程[3，4]，参与体内平衡和基因表达[5]，以及参与对病菌和昆虫的防御等[6，7]。

胱硫醚-γ-合成酶（CGS）是甲硫氨酸生物合成途径中的一个关键酶，其表达受到底物的反馈抑制。严密精确的调控对于植物胱硫醚-γ-合成酶的表达来说非常重要。拟南芥中胱硫醚-γ-合成酶的下调会导致严重的生长延迟现象，影响植物的顶端优势和花器官的发育，此外也会明显降低叶绿体的含量[8，9]。而在拟南芥、马铃薯、番茄中过量的胱硫醚-γ-合成酶引起的过高的甲硫氨酸含量同样会导致这些植物不正常的表型[10-11]。

目前对植物中参与甲硫氨酸代谢的调控因子的研究主要集中在营养组织中，在种子中的研究则很少。为此，利用NCBI的数据库获得已知的烟草胱硫醚-γ-合成酶基因的序列信息，以此设计引物检测到在烟草合子中存在一种新型胱硫醚-γ-合成酶基因NtCGS-4的表达。并通过染色体步移技术获得了NtCGS-4基因的5′侧翼序列（启动子和5′UTR）。新获得的在烟草早期胚胎发生中表达的新型胱硫醚-γ-合成酶基因为进一步研究甲硫氨酸在植物种子发育中的生物学功能和调控机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 试验材料为野生型烟草（Nicotiana tabacum var. SR1），种植于长江大学生命科学学院所属温室内，室温25 ℃，光照周期16 h/8 h。

1.1.2 主要试剂和质粒 普通DNA片段回收试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司），DNeasy Plant Mini Kit试剂盒（QIAGEN公司），Universal GenomeWalker Kit试剂盒（Clontech公司），Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit 试剂盒（Life technologies公司），反转录酶SuperScripIII（Life technologies公司），DNA聚合酶Ex Taq（Takara公司），DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB公司），pGEM-T Easy vector（Promega公司），大肠杆菌DH5α感受态细胞为实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 烟草合子的分离 取人工授粉后96 h左右的SR1的胚珠用于合子分离，方法参照文献[12]。将分离的合子收集至预先加入5 μL 2×Lysis/ Binding Buffer的PCR管中，管内最终总体积不超过10 μL，-80 ℃冰箱保存。同时挑选部分合子以FDA（Fluorescein Diacetate）染色检测活性，并使用Cooled CCD采集图像。

1.2.2 合子cDNA的制作和基因片段的获取 按照Dynalbeads mRNA DIRECT Micro kit试剂盒的要求提取合子的mRNA，并使用Superscript III反转录酶合成cDNA第一链。使用Primer Premier 5软件在NCBI提供的胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）序列两端设计检测引物（表1）进行PCR反应，（98 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，39个循环；72 ℃延伸5 min，于4 ℃保温，Pushion高保真酶扩增）。凝胶检测并测序。

1.2.3 NtCGS-4基因5′侧翼序列的克隆 按照Universal GenomeWalker Kit试剂盒制作walking文库，并按照要求设计GSP引物（表2）。反应体系和反应条件参照试剂盒要求，引物退火温度灵活掌握。经过三轮扩增后序列无法继续延伸，将序列拼接后进行检测。

1.2.4 生物信息学分析 利用ExPASy（http：//web.expasy.org）的Protparam预测蛋白质的氨基酸组成和理论等电点。利用NCBI的blastx搜索NtCGS-4蛋白的同源氨基酸序列，利用软件Clustalx 1.83进行同源比对，并用MEGA 4构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 分离烟草SR1的合子

利用酶解和玻璃棒挤压能有效分离出授粉后96 h的SR1胚珠的胚囊，为了获得干净无母体组织污染的合子，则必须进行二次酶解才能将其彻底从胚囊中分离。从图1可以看出，分离后的合子背景干净，形态正常，没有破裂。FDA是荧光素双醋酸酯，本身并无荧光，其进入细胞内后便产生荧光素。由于FDA不能自由进入细胞膜，所以有活力的细胞才能发出荧光。用FDA分离的合子进行染色发现其荧光强烈，这说明分离的合子状态良好，具有较好的活性，可以用于下一步的mRNA的提取。

2.2 合子cDNA中胱硫醚-γ-合成酶基因的检测

利用NCBI查询到烟草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的cDNA序列有1 882 bp，含有一个1 620 bp的开放阅读框。分析序列发现该基因含有一个SSR多态性位点（GCC7）。利用Primer Premier 5引物设计软件在序列两端设计检测引物（表1），用成功提取的合子cDNA进行PCR扩增。扩增结果显示，在合子cDNA中有预期的1.6 kb左右的条带出现（图2），回收测序显示确是烟草胱硫醚-γ-合成酶基因片段。结果表明在受精后不久的烟草SR1的合子中的确有甲硫氨酸的合成。

需要特别指出的是测序发现PCR产物长度为1 677 bp，其中有一种新型序列与烟草胱硫醚-γ-合成酶基因（KJ001150）的相似度在98%，主要在SSR位点有差异。因NCBI数据库中已存在3种烟草胱硫醚-γ-合成酶基因，故将新发现的基因命名为NtCGS-4，其SSR位点为（GCC3），拥有胱硫醚γ-合成酶的保守功能结构域（图3）。这与烟草基因组是异源四倍体，且多态性位点较为丰富的特点相符。

2.3 NtCGS-4基因5′侧翼序列的克隆

按照扩增得到的NtCGS-4基因的cDNA序列设计引物，直接使用染色体步移技术来获取NtCGS-4基因的5′侧翼序列。第一轮扩增得到的延伸片段，与“2.2”中扩增得到的NtCGS-4基因的序列拼接后，设计检测引物在基因组上进行检测。结果证实NtCGS-4基因在图3所示片段的基础上向5′方向延伸了1 537 bp。利用本实验室烟草基因组数据库进行Blast比对，发现有一段787 bp的片段能够与NtCGS-4基因的5′新增序列拼接成功，其中有282 bp完全重合。继续在此基础上又进行了两轮染色体步移，分别新增NtCGS-4基因5′侧翼序列161 bp和511 bp。至此将所有新增序列和“2.2”中扩增的序列拼接后分析发现，NtCGS-4基因的CDS的起始密码子ATG之前共存在2 696 bp的侧翼序列，包括启动子和5′UTR。拼接序列经基因组检测符合预期（图4）。

2.4 NtCGS-4蛋白理化性质

使用在线的Protparam工具对NtCGS-4基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析，结果见表3。从表3可以看出，NtCGS-4蛋白由537个氨基酸组成，包含全部20种基本氨基酸类型，分子质量57.931 2 ku，pI为6.15，属酸性蛋白。该蛋白的正、负电荷残基分别为47、54个，脂肪系数95.74，不稳定性指数37.68，分析还显示NtCGS-4蛋白的平均总疏水性为0.078。

2.5 NtCGS-4蛋白氨基酸序列的同源比对和系统进化分析

利用Blastx搜索烟草胱硫醚-γ-合成酶的同源序列，发现在番茄、马铃薯、欧洲油菜、水稻、玉米等农作物以及拟南芥中都存在与之类似的蛋白序列。其中烟草本身已有3种胱硫醚-γ-合成酶基因。以烟草NtCGS-4蛋白为例，其与烟草中其他3种胱硫醚-γ-合成酶以及不同物种之间的胱硫醚-γ-合成酶的同源性都很高，氨基酸序列相似度均达到80%以上。对不同物种中胱硫醚-γ-合成酶的氨基酸序列进行比对，发现这些序列的C端都拥有一段极其保守的功能区段。但是在此区段以外，不同物种间的序列差别较大，说明这些区域进化速度较快。选取不同物种的胱硫醚-γ-合成酶序列构建系统进化树，发现同属茄科的番茄、马铃薯和烟草属于同一分支，十字花科的欧洲油菜和拟南芥属于同一分支，单子叶植物水稻、玉米则亲缘关系较近（图5）。值得注意的是，烟草和马铃薯各有-种胱硫醚-γ-合成酶与自身的其他胱硫醚-γ-合成酶亲缘关系较远，显示了胱硫醚-γ-合成酶的进化途径的多样化。

3 小结与讨论

植物中的甲硫氨酸是动物和人类重要的食物来源，但是甲硫氨酸在大多数的谷类植物中含量非常低。传统的植物培育方法在提高作物甲硫氨酸水平上的作用不太明显。现在依靠转基因技术手段在一些情况下能大幅提高作物的甲硫氨酸含量。但是转基因植株有时也会表现出不正常的表型，比如生长严重延迟，叶子结构发生变化，块茎产量下降40%～60%，块茎的颜色发生变化[11]。

植物种子发育起源于合子，合子经过多次分裂与分化最终形成成熟胚胎，因此胚胎发育对于植物种子的正常形成十分重要。但关于甲硫氨酸在早期胚胎发生中的合成与代谢的认识还非常有限。本研究克隆了一个在烟草合子中表达的新型胱硫醚-γ-合成酶基因，并通过染色体步移技术获取了其5′端侧翼序列。这为进一步了解甲硫氨酸在烟草早期胚胎发生中的合成与代谢机制打下基础。许多农作物的可利用部位是种子，本研究可为培育拥有高含量甲硫氨酸，且种子形态变化小的农作物提供帮助。

参考文献：

[1] GALILI G，AMIR R，HOEFGEN R，et al.Improving the levels of essential amino acids and sulfur metabolites in plants[J].Biol Chem，2005，386（9）：817-831.

[2] ROJE S.S-Adenosyl-L-methionine：Beyond the universal methyl group donor[J].Phytochem，2006，67（15）：1686-1698.

[3] YANG S，YIP W K，DONG J G.Mechanism and regulation of ethylene biosynthesis[J].Am Soc Plant Physiol，1990，5：112-115.

[4] MATILLA A J. Ethyelene in seed formation and germination[J]. Seed Sci Res， 2000， 6：111-126.

[5] PANG X M，ZHANG Z Y，WEN X P， et al. Polyamines，all-purpose players in response to environment stresses in plants[J]. Plant Stress， 2007，1：173-188.

[6] GIGOLASHVILI T，YATUSEVICH R，BERGER B，et al.The R2R3-MYB transcription factor HAG1/MYB28 is a regulator of methionine-derived glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J].Plant J，2007，51（2）：247-261.

[7] HIRAI M Y，SUGIYAMA K，TOHGE Y，et al. Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（15）：6478-6483.

[8] GAKIERE B，RAVANEL S，DROUX M，et al. Mechanisms to account for maintenance of the soluble methionine pool in transgenic Arabidopsis plants expressing antisense cystathionine gamma-synthase cDNA[J].C R Acad Sci III，2000，323：841-851.

[9] KIM J，LEUSTEK T.Repression of cystathionine g-synthase in Arabidopsis thaliana produces partial methionine auxotrophy and developmental abnormalities[J].Plant Sci，2000，151：9-18.

[10] HACHAM Y，AVRAHAM T，AMIR R. The N-terminal region of Arabidopsis cystathionine gamma-synthase plays an important regulatory role in methionine metabolism[J]. Plant Physiol，2002，128（2）：454-462.

[11] DANCS G，KONDRAK M，BA′NFALVI Z.The effects of enhanced methionine synthesis on amino acid and anthocyanin content of potato tubers[J]. BMC Plant Biol，2008，8：65-75.

[12] HE Y C，SUN M X，YANG H Y.Regeneration of fertile plants from isolated tobacco zygotes by in vitro culture[J].Chin Sci Bull，2004，49（8）：810-814.