下丘脑伏隔核外源性GABA对大鼠胃功能的影响及潜在机制*

王 茜， 冷 慧， 栾 晓， 郭菲菲， 高胜利， 孙向荣， 徐 珞

(青岛大学基础医学院病理学与病理生理学系， 山东 青岛 266071)

中枢神经系统参与调节摄食和能量代谢，并且通过调节特定脑区的摄食相关肽，进而与外周器官(如胃肠道)密切联系，从而保证内环境稳态。近年来，大量研究探讨γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)对摄食及能量代谢的调控作用[1]，但较少涉及GABA对胃肠道的影响。

GABA是一种广泛分布于哺乳动物体内的抑制性神经递质，其受体可根据药理特征分为GABA-A受体(GABA-A receptor，GABA-AR)、GABA-B受体和GABA-C受体，其中GABA-AR为中枢神经系统内主要的抑制性受体[2]。GABA可活跃脑内葡萄糖代谢，促进乙酰胆碱的合成，抗惊厥，降低血压，并维护脑细胞正常功能[2]。此外，先前已有研究表明GABA可能对胃肠运动具有调节作用[3]，但目前尚不清楚GABA受体信号通路参与调节胃运动或胃酸分泌的潜在机制。

伏隔核(nucleus accumbens，NAc)是中枢神经系统中参与调控摄食及奖励性进食的重要核团之一，与调控胃功能也密切相关[4-5]。NAc位于前脑底部背侧纹状体腹侧，包括核部和壳部2个亚区[6]。NAc内的GABA能中脊神经元可整合传递来的信息，并继续传递到基底神经节的腹侧苍白球和黑质，从而参与调控稳态平衡，尤其是对动机和情绪等相关活动所引起的摄食行为的调节[2]。

胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，是目前发现的几种厌食性神经肽之一，因其在调节摄食及降低血糖等方面的作用而受到广泛关注[7]。GLP-1能神经元主要位于孤束核(nucleus tractus solitarius，NTS)，并可投射到进食相关的许多脑区，如NAc和中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)[8]。GLP-1还能够延缓胃内容物排空；此外，胃牵张(gastric distension，GD)刺激可使GLP-1能神经元兴奋[9]。

目前尚不清楚下丘脑NAc外源性GABA对胃牵张敏感神经元的调控及其潜在机制，以及GLP-1受体信号通路是否参与其中。本实验旨在观察NAc内GABA对大鼠的胃运动、胃酸分泌及GD敏感神经元兴奋性的影响，同时探究GLP-1R信号通路对其调控作用。

材 料 和 方 法

1 实验动物

雄性健康SD大鼠(体质量为180～220 g)，购自山东省青岛市药物检验研究所，动物合格证编号为SCXK(鲁)0013329。实验动物房温度设置为(21±3)℃，相对湿度为(60±5)%，光/暗周期为12 h，大鼠可自由饮水进食。本实验饲养大鼠及实验方法均经青岛大学动物保护机构委员会批准，符合伦理学要求。

2 实验仪器及试剂

大鼠脑立体定位仪(Scientifica)；荧光显微镜(Olympus)；冰冻切片机(Kryostat 1720，Leica)。Cy3标记的IgG抗体购自Jackson ImmunoResearch；GABA、抗 GABA-AR 抗体、GABA-AR拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculline, BIC)、抗GLP-1R抗体和GLP-1R拮抗剂exendin 9-39(Ex9)均购自Sigma。

3 方法

3.1实验分组 实验1采用荧光免疫组化染色法，以10只大鼠为实验对象，主要观察NAc内GABA-AR免疫阳性神经元及GLP-1R免疫阳性神经元的分布。实验2采用单细胞外放电记录实验，随机选取65只大鼠，探究微量注射GABA、GABA-AR拮抗剂BIC、GLP-1及GLP-1R拮抗剂Ex9对大鼠NAc内GD神经元兴奋性的影响。实验3采用胃运动实验，通过对GLP-1R信号通路的调控，观察NAc外源性GABA及其受体对胃运动的影响。随机选取48只大鼠并分为8组：(1)0.5 μL生理盐水(normal saline，NS)组；(2)0.5 μg/0.5 μL GABA；(3)2.5 μg/0.5 μL GABA；(4)5.0 μg/0.5 μL GABA；(5)10.0 μg/0.5 μL BIC组；(6)10.0 μg/0.25 μL BIC+2.5 μg/0.25 μL GABA组；(7)10.0 μg/0.5 μL Ex9组；(8)10.0 μg/0.25 μL Ex9+2.5 μg/0.25 μL GABA组。实验4采用胃酸分泌实验，随机选取48只大鼠并分为8组，分组情况同实验3。

3.2荧光免疫组织化学染色实验 大鼠以硫代巴比妥钠(0.1 g/kg，ip)麻醉后以4%多聚甲醛溶液灌注固定，以冰冻切片机连续冠状切片(厚15 μm)，-20 ℃冰箱避光冻存。选取具有合适的NAc区域部位[10]的切片置于室温环境，加入正常羊血清避光孵育2 h，加入抗GABA-AR抗体(1∶500)和抗GLP-1R抗体(1∶300)，空白对照组以正常羊血清代替 I 抗，同时避光过夜处理；加入Cy3标记的羊抗兔抗体(1∶400)室温环境避光孵育2 h，最后以PBS清洗切片并防淬灭荧光封片剂封片。BX50显微镜下观察实验结果，以DP50数码相机(Olympus)拍照，并以Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件进行平均吸光度分析。

3.3脑部置管 大鼠禁食过夜，以硫代巴比妥钠(0.1 g/kg，ip)麻醉并固定于三维脑立体定位仪(Narashige SN-3)。参照大鼠脑图谱，在NAc(前囟1.70 mm，旁开0.80 mm，颅骨下5.50 mm)内植入不锈钢导管(26号，15 μm)，内置内芯防止堵塞。内部给药套管(29号，10 μm)经聚乙烯管(10 cm)与微量注射器连接以便注射药物。大鼠术后连续3 d腹腔注射8×104U青霉素防止感染，单笼饲养恢复7 d再行后续实验。

3.4电生理实验 大鼠禁食过夜，以腹腔注射10%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，沿其腹中线行一纵行切口，胃底行一小切口并取出胃内容物。乳胶球囊(3～4 cm)通过切口插入胃腔并连接于聚乙烯管，结扎固定于切口边缘，关闭腹腔。球囊充盈后的体积大于胃膨胀的容积，以此作为GD刺激。GD刺激时，向球囊内以每秒0.5 mL的速度充入3～5 mL温水(37 ℃)。

腹部手术后，大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪。充分暴露大鼠颅骨后用牙科钻钻一小洞，切开硬脑膜并暴露脑组织，滴加温琼脂(3%生理盐水)以保护神经元稳定性。在脑立体定位仪引导下，用液压推进器将事先拉制的5管玻璃微电极(尖端直径10～20 μm，电阻5～15 MΩ)垂直置于NAc(位置如前)。记录电极充以0.5 mol/L乙酸钠和20 g/L的滂胺天蓝，用于神经元放电记录。另外4管根据分组情况分别充以NS、GABA(10 nmol/L)、GLP-1(15 nmol/L)、BIC(20 nmol/L)或Ex9(20 nmol/L)。在NAc内微量注射GABA(10 nmol/L)，观察GABA对NAc内GD神经元放电活动的影响；待神经元放电活动恢复，预先微量注射BIC(20 nmol/L)或Ex9(20 nmol/L)后再次微量注射GABA，观察GABA所诱导放电效应的改变。以MEZ-8201型微电极放大器将所得电信号经输入VC-11双道示波器，进行放电频率处理与分析(SUMP-PC生物信号系统)。神经元兴奋或抑制指标为放电频率变化率超过20%，依据其放电频率升高或降低，将GD敏感神经元进一步分为胃牵张兴奋(GD-E)神经元和胃牵张抑制(GD-I)神经元。

3.5胃运动的测定 选择脑部置管的大鼠，术前大鼠禁食18 h，硫代巴比妥钠(0.1 g/kg，ip)麻醉后，沿大鼠环形肌方向在距幽门0.5 cm处缝合嵌入应力传感器。术后大鼠经7 d恢复期，无疼痛或应激反应再行后续实验。以胃运动生理记录仪(3066-23，四川成都精密仪器公司)收集并记录大鼠胃收缩幅度及频率。注药前记录稳定30 min，注药后再记录60 min。

胃收缩幅度或频率变化率(%)=(注射药物后幅度或频率-注射药物前幅度或频率)/注射药物后幅度或频率×100%。

3.6测定胃酸分泌量 大鼠禁食16 h后，腹腔注射硫代巴比妥钠(0.1 g/kg)进行麻醉。沿大鼠腹部中线放置双腔插管，结扎贲门及幽门处。在0.5 h内，收集5 mL灌流液，并计算其中的胃液排出量，以此作为基础胃酸分泌量。通过自动滴定仪(COM-2500，Hiranuma Sangyo)用100 mmol/L氢氧化钠滴定灌流液直至pH值为7.0。pH值以pH计(Thermo Fisher Scientific)测量。总酸产量(μEq)=滴定酸度(mL)×2×10。

3.7组织学检验 细胞外放电记录实验结束后，微电极接阴极，无关电极接阳极，50 μA的直流电通电 20 min，使电极内滂胺天蓝以微电泳形式进入脑组织并标记电极所在部位。4%多聚甲醛溶液灌注固定并快速断头取脑，甲醛溶液内浸泡2 d，连续冠状50 μm切片，以中性红染色并检查电极记录位置，舍弃位置不符的实验数据。

4 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件进行分析。实验结果表示为均数±标准差(mean±SD)。两独立样本间比较采用t检验。多样本均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用的Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NAc内GABA-AR和GLP-1R的表达

为探讨GABA或GLP-1是否能通过其受体激活NAc神经元，观察在NAc中GABA-AR或GLP-1R的表达。荧光免疫组织化学结果显示，大鼠NAc可见GABA-AR(图1A)或GLP-1R(图1B)免疫阳性神经元，且部分神经元呈GABA-AR和GLP-1R抗体双染现象，见图1C。经Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件计数可得，在NAc内GABA-AR平均吸光度值为0.487±0.024，GLP-1R平均吸光度值为0.418±0.019，双染平均吸光度值为0.198±0.013，提示NAc可能为GABA或GLP-1的作用位点之一。

2 GABA对大鼠NAc内GD神经元放电活动的影响

在65只大鼠的NAc中共记录到164个神经元的自发放电活动，其中有119个(119/164，72.56%)神经元对GD刺激有反应。在这119个神经元中，78个为GD-E神经元，41个为GD-I神经元。

为观察GABA对大鼠NAc内GD神经元放电活动的影响，于NAc内微量注射GABA。在78个GD-E神经元中，有47个神经元的放电频率从(3.84±0.09) Hz降低到(1.15±0.05) Hz(P<0.05)，平均降低(70.05±20.21)%；在41个GD-I神经元中，有27个神经元的放电频率从(3.81±0.14) Hz下降到(1.13±0.05) Hz(P<0.05)，平均下降(70.34±21.71)%，见图2、表1。

Figure 1.GABA-AR and GLP-1R immunoreactive neurons in the NAc. A: GABA-AR immunoreactive neurons in the NAc; B: GLP-1R immunopositive neurons in the NAc; C: two-receptor dual-labeled neurons in the NAc; D: the position of the mouse brain map is displayed, and the red part indicates NAc. The scale bar=100 μm.

图1 NAc中GABA-AR和GLP-1R免疫阳性反应神经元

Figure 2.The effect of microinjection of GABA on the discharge activity of GD neurons in the NAc. A: GD-E neurons; B: GD-I neurons; C: GD neuron discharge rate changes. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vs1GABA group.

图2 NAc微量注射GABA对GD神经元放电活动的影响

表1 GABA对大鼠NAc内GD神经元放电活动的影响

Table 1.The effect of GABA on the discharge activity of GD neurons in rat NAc

NeuronnGABA responsivenessInhibitoryExcitatoryUnresponsiveGD-E7847(60.25%)19(24.36%)12(15.38%)GD-I4127(65.85%)9(21.95%)5(12.19%)

GD-E: gastric distension excitation; GD-I: gastric distension inhibition.

为了进一步探究参与该过程的受体信号通路，本研究应用了GABA-A受体拮抗剂BIC和GLP-1受体拮抗剂Ex9，观察两者对GABA效应的影响。大鼠NAc预先微量注射BIC或Ex9，GABA对GD神经元放电频率的抑制作用可被BIC完全阻断(P<0.05)，或被Ex9部分拮抗(P<0.05)，提示GABA对GD神经元放电活动的影响作用可能主要依赖于GABA-A受体信号通路，且该过程涉及GLP-1受体信号通路；而单独注射BIC对NAc内GD神经元的放电活动没有明显影响(P>0.05)，见图2(BIC部分未显示)。

3 NAc微量注射GABA对大鼠胃运动的影响

在胃运动曲线稳定的情况下，向NAc微量注射不同浓度的GABA。结果表明，GABA可明显增加胃收缩幅度和频率，且呈剂量依赖关系(P<0.05或P<0.01)，见图3。注射GABA后3 min左右，大鼠胃收缩幅度和频率在8～13 min左右达到最大值。大鼠NAc微量注射GABA(2.5 μg)+BIC(10.0 μg)，或GABA(2.5 μg)+Ex9(10.0 μg)，BIC可显著降低GABA对胃运动的兴奋作用(P<0.01),而Ex9可部分减弱GABA诱导的胃运动(P<0.05)，见图3。这提示NAc内GABA-AR或GLP-1R信号通路在NAc对胃运动的调节中起重要作用。NS、BIC和Ex9对胃运动无明显影响。

Figure 3.The effects of GABA microinjection into NAc on gastric motility. A: the rate of change in gastric motion amplitude; B: the rate of change in gastric motion frequency. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vs0.5 μg GABA group;△P<0.05,△△P<0.01vs2.5 μg GABA group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vs10.0 μg Ex9 group.

图3 NAc内微量注射GABA对胃运动的影响

4 NAc微量注射GABA对大鼠胃酸分泌的影响

与NS组相比，NAc微量注射GABA，大鼠胃液量和胃酸输出量均明显升高，且呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01)，见图4。而大鼠NAc微量注射GABA(2.5 μg)+BIC(10.0 μg)，或GABA(2.5 μg)+Ex9(10.0 μg)，BIC可显著降低GABA诱导的胃酸分泌增加(P<0.01)，Ex9可部分拮抗GABA诱导的胃酸分泌增加，pH值高于2.5 μg GABA组(P<0.05)，见图4。这提示GABA可通过GABA-AR信号通路影响胃酸分泌，其调控过程涉及GLP-1受体信号通路。NS、BIC和Ex9对胃酸分泌无明显影响。

Figure 4.The effects of GABA microinjection at different concentrations in the NAc on gastric acid secretion. A: gastric juice volume; B: gastric acid output. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;△△P<0.01vs2.5 μg GABA group;▲▲P<0.01vs10.0 μg Ex9 group.

图4 NAc内微量注射不同浓度GABA对胃酸分泌的影响

讨 论

胃牵张刺激是一种可以引起胃部肌肉被动牵张，并刺激胃部传入神经信号的传递，进而对神经系统诱导的摄食行为产生负反馈调节的刺激活动[11]。各种动物实验均证实，表达于特定脑核[12]的各个神经肽可参与调控胃运动、胃酸分泌以及胃排空。已有研究报道，NAc可以参与中枢神经系统对能量平衡和胃肠功能的调控[13]。确切地说，在脑-胃肠轴之间复杂的相互作用中，NAc可参与中枢神经系统对胃肠道内传入和传出信息的整合，并通过对各种神经肽的调节进而参与调控胃肠功能。本研究发现，大鼠NAc内存在GD反应性神经元，这些神经元同时也对GLP-1敏感，GLP-1使NAc内部分GD-E神经元和GD-I神经元的放电频率增加。

GABA是脑内重要的抑制性递质，在NAc中具有其特殊的促摄食作用[13]。据先前的研究结果，GABA神经元可参与胃肠功能的调节[14]。在大鼠NAc中微量注射GABA可促进大鼠胃运动，且GLP-1R拮抗剂Ex9可部分减弱该促进作用。因此，外源性GABA在NAc中可能具有一定的兴奋性促胃运动作用，且主要通过GABA-AR信号通路来调节该过程，并且GLP-1R信号通路也可能参与这一调控过程。通过荧光免疫组织化学染色观察到GABA-AR和GLP-1R免疫反应神经元在大鼠NAc中的共表达，这与先前研究结果一致[15]，表明NAc是GABA和GLP-1共同的作用位点之一。

GLP-1及其受体信号通路在维持能量平衡中起着重要的生理作用[16]。目前研究发现，脑室内注射GLP-1受体拮抗剂可增加摄食量[17]。若通过RNA干扰诱导NTS中GLP-1的前体胰高血糖素mRNA下调，则会引起暴饮暴食和体重增加的现象[18]。此外，已有研究发现，NAc内GLP-1受体的激活可增加谷氨酸能AMPA/kainate信号，从而抑制摄食行为[19]。本研究中大鼠NAc内注射GABA可增强胃运动和胃酸分泌，而GLP-1受体拮抗剂可部分拮抗该效应，据此推测外源性GABA对胃运动和胃酸分泌起作用的潜在机制可能涉及GLP-1受体信号通路。

综上所述，NAc中GABA通过调控GD神经元的放电活动参与胃传入信号的调控；还可增加胃动力和胃酸分泌，此为影响胃部传出信号的结果；且中枢GLP-1R信号也参与该调节过程；此外，经荧光免疫组织化学染色证实，NAc内GABA-A受体和GLP-1受体共染。总之，GLP-1受体信号通路参与调节NAc内GABA-A受体信号通路对胃肠道传入及传出信息的处理及调控。