和厚朴酚通过mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞自噬*

罗 敏， 缪 萍， 吴爱祥， 邵中一， 杨 华， 苏赛赛

(鄞州人民医院， 浙江 宁波 315040)

肺癌是我国发病率最高的肿瘤之一，同时具有低龄化发展的趋势，因此，针对肺癌的研究一直是抗肿瘤研究的重点[1]。和厚朴酚(honokiol)为一种带有烯丙基的联苯二酚类化合物，是从中药厚朴中提取到的主要活性物质，具有广泛的生物学活性，包括抗菌、抗炎、中枢性肌肉松弛和神经抑制作用、抗血小板、降低胆固醇及抗肿瘤等药理作用[2-3]。近年研究表明，honokiol对乳腺癌[4]、结肠癌[5]和前列腺癌[6]等肿瘤都有抑制作用，其作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭转移、抑制肿瘤血管形成、抑制酶的活性以及蛋白质的合成等有关。然而，honokiol是否诱导肺癌细胞自噬，目前未见报道。因此，本实验通过体外研究观察honokiol对非小细胞肺癌A549细胞自噬的作用及可能的作用机制，旨在为honokiol用于肺癌的临床治疗提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞株 人肺癌细胞系A549购自中国科学院上海细胞所。

1.2主要试剂 Honokiol购自西安天一生物技术有限公司，纯度>99%;吖啶橙(acridine orange)、二甲基亚砜(DMSO)和雷帕霉素(rapamycin)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)购自Sigma；胰蛋白酶和RPMI-1640培养基购自吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自Gibco；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于碧云天生物公司；抗LC3、p-mTOR、mTOR和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1细胞培养 肺癌A549细胞于含10%小牛血清，1.0×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。每3 d传代1次。

2.2MTT实验检测细胞活力 消化A549细胞调整细胞悬液浓度，以每孔5.0×103个细胞接种于96孔板中，将细胞培养板置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养过夜。第2天实验组中加入不同浓度的honokiol，其浓度分别为10、20、40、60和80 μmol/L，对照组中加入等体积的PBS，每个浓度设置6个复孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入浓度为2 g/L的MTT 20 μL，在培养箱中继续培养4 h后，弃去96孔板中的液体，每孔加入DMSO 150 μL，将96孔板低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定490 nm波长处各孔吸光度(A)值。实验重复3次。

2.3吖啶橙染色 收集A549细胞，将细胞以5×107/L的细胞悬液接种于24孔板，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育培养过夜，第2天加入不同浓度的honokiol和rapamycin作用于肺癌A549细胞48 h， 弃去24孔板中的旧培养液，用PBS清洗3遍，用含终浓度为1 mg/L的吖啶橙溶液避光染色15 min，用PBS清洗染色后的细胞，清洗3遍，置倒置荧光显微镜下进行观察，拍照。实验重复3次。

2.4Western blot法检测蛋白表达水平 收集肺癌A549细胞，将细胞以1×108/L接种于6孔板中，每孔2 mL，置培养箱培养过夜。对照组给予正常培养液，给药组分别给予honokiol (40 μmol/L)和honokiol (40 μmol/L)+3-MA (10 mmol/L) 48 h，其中3-MA在收细胞前2 h加入。收集各组药物处理后的细胞，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度进行定量。将定量后的蛋白样品加入到配制好的丙烯酰胺凝胶泳道中电泳分离， 然后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，用含5% BSA将膜封闭1 h，TBST清洗3次，分别加入对应I抗LC3(1∶1 000)、p-mTOR (1∶1 000)、mTOR (1∶1 000)和GAPDH (1∶2 000)，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜后，加入对应羊抗兔II抗 (1∶3 000)，室温摇床孵育2 h后，TBST洗膜3次，ECL发光试剂盒显色，采用化学发光成像系统进行曝光采图，从而进行半定量分析。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 和厚朴酚抑制肺癌A549细胞活力

采用MTT法检测honokiol对肺癌A549细胞活力的影响，实验结果显示，与对照(0 μmol/L)组相比，不同浓度的honokiol对肺癌A549细胞活力产生明显影响，honokiol能显著抑制肺癌A549细胞活力(P<0.01)，并呈一定的剂量依赖关系，见图1。在给药48 h后，honokiol的IC50为60.05 μmol/L。

Figure 1.The effect of different concentrations of honokiol on the viability of A549 cells after 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图1 不同浓度的和厚朴酚对肺癌 A549 细胞活力的影响

2 和厚朴酚促进肺癌A549细胞自噬溶酶体的生成

吖啶橙染色可使细胞中酸性自噬泡发出红色荧光。结果显示，雷帕霉素(100 nmol/L)作为阳性对照处理细胞后细胞中发出红色荧光的酸性自噬泡的比例明显增多；honokiol(20和40 μmol/L)作用于肺癌A549细胞48 h后，细胞中发出亮红色荧光的酸性自噬泡的比例增多，其中以40 μmol/Lhonokiol效果最为明显，见图2。因此，后续实验选择40 μmol/L作为实验浓度。

Figure 2.The changes of autophagy levels in A549 cells after treated with honokiol (acridine orange staining, ×400).

图2 不同浓度的和厚朴酚对肺癌A549细胞自噬的影响

3 和厚朴酚增加肺癌A549细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达

在40 μmol/L的honokiol作用下，自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ表达水平显著升高(P<0.01)；然而，联合自噬抑制剂3-MA作用则能明显下调由honokiol诱导的LC3-Ⅱ蛋白表达水平(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The protein levels of LC3-Ⅱ in the lung cancer A549 cells treated with honokiol. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshonokiol group.

图3 和厚朴酚对肺癌A549细胞LC3蛋白表达的影响

4 和厚朴酚抑制肺癌A549细胞mTOR信号通路

Western blot检测结果显示，肺癌A549细胞在40 μmol/L的honokiol作用48 h后，与空白对照组相比，honokiol可显著降低p-mTOR的蛋白表达水平(P<0.01)；联合自噬抑制剂3-MA作用后，p-mTOR蛋白表达水平呈显著升高(P<0.01)，而mTOR的总蛋白水平无明显变化，见图4。

Figure 4.The protein levels of p-mTOR in the lung cancer A549 cells treated with honokiol. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vshonokiol group.

图4 和厚朴酚对肺癌A549细胞p-mTOR蛋白表达的影响

讨 论

肺癌是全球危害性最大的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在全球持续上升，且低龄化趋势越来越明显。化疗是目前肺癌有效的治疗方法之一，但化疗的毒副作用较大，在临床应用方面受到了很大的限制，故寻找治疗肺癌的新方法及新策略是研究的热点[7]。和厚朴酚为联苯二酚类化合物，是从中药厚朴中提取到的主要活性物质，具有广泛的生物学活性。Honokiol通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移、抑制肿瘤组织血管生成等来发挥其抗肿瘤的作用[8-9]。研究表明，honokiol可抑制人肺小细胞癌N446细胞的增殖，并诱导 N446 细胞凋亡[10]。Wang等[11]报道honokiol能增强紫杉醇药物的敏感性。自噬又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，广泛存在于真核细胞，对细胞的生长发育和调节细胞内环境的稳定起着重要作用。目前普遍认为自噬是一种防御和应激调控机制，当肿瘤细胞受到各种损伤因素作用时，自噬可以成为细胞应激条件下的一种保护反应[12]。大量研究表明，大多数抗肿瘤药物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时也诱导了肿瘤细胞发生自噬，该自噬可以成为细胞应激条件下的一种保护性反应，使细胞维持自身微环境的稳态，从而耐受化疗药物的细胞毒性[13]。本研究通过检测吖啶橙染色及自噬相关蛋白分子LC3-II表达的变化，表明了honokiol诱导肺癌A549细胞发生自噬。由于自噬的特点，药物诱导肿瘤细胞发生自噬有2种不同的结果，一种是细胞在应激条件下的一种保护反应，而另一种则是启动细胞Ⅱ型程序性细胞死亡。应用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后，观察到3-MA 减弱了honokiol对A549 细胞自噬水平的抑制作用，结合Luo等[14]报道honokiol联合应用自噬抑制剂3-MA可抑制肺癌A549细胞的增殖，提示自噬是honokiol的抗肿瘤作用机制而不是细胞自身的一种保护性机制。

目前已发现调控自噬的上游相关信号通路有很多条，包括mTOR、PI3K/AKT、ROS和NF-κB信号通路等，其中mTOR信号通路是研究广泛的信号通路之一，而其核心蛋白 mTOR的活化是决定自噬体形成和成熟的关键蛋白[15-16]。在生长因子和应激等情况下，mTOR被激活，呈磷酸化状态，它可以磷酸化其下游靶点，抑制细胞自噬，促进细胞增殖，因此，mTOR 对细胞自噬起负向调控作用。应用Western blot 方法检测honokiol对肺癌A549细胞mTOR的影响，实验结果显示honokiol可显著抑制肺癌A549细胞中p-mTOR的表达，表明honokiol可显著抑制肺癌A549细胞内mTOR的活化。同时加入自噬抑制剂3-MA 和honokiol时，与单独加入honokiol相比，p-mTOR表达有所恢复,说明抑制细胞自噬，可削弱honokiol对肺癌细胞内p-mTOR的抑制作用，提示honokiol可能通过抑制mTOR信号通路诱导肺癌A549细胞发生自噬。

综上所述， 本实验通过检测自噬溶酶体、自噬标志物以及相关的信号通路，研究honokiol对肺癌 A549细胞自噬的影响，表明一定剂量的honokiol可诱导肺癌细胞自噬，并且该作用可能通过抑制mTOR信号通路有关，为honokiol在肺癌的临床应用提供参考资料。