木犀草素逆转由TGF-β1诱导的人肺癌细胞上皮-间充质转化的实验研究*

缪存静， 陈俊杰， 历 星， 林鹏程， 胡 全

(1浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区药学部， 浙江 杭州 310018； 2温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科， 浙江 温州 325000； 3杭州师范大学医学院药学系， 浙江 杭州 310036)

肺癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年升高，其中非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%[1]。侵袭和转移是肺癌患者死亡的重要原因，也是肺癌治疗中最为棘手的问题。上皮-间充质转化(epithe-lial-mesenchymal transition, EMT)被认为是肿瘤转移或扩散早期的重要环节，一直为肿瘤侵袭转移研究的热点[2]。木犀草素(luteolin)是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用[3]。研究报道luteolin对肝癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用[4-5]，同时也发现EMT在乳腺癌、结肠癌和胃癌等多种肿瘤的侵袭和转移中起着非常重要的作用[6-7]。但luteolin对由转化生长因子 β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导的肺癌细胞EMT是否有影响，尚无相关报道。由于转移是导致肺癌临床治疗失败和患者死亡的主要原因，因此，研究肺癌侵袭和转移的分子机制对治疗肺癌和提升患者的生存率有重要意义。本研究采用TGF-β1诱导肺癌细胞建立EMT模型，探讨luteolin对TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT的逆转作用，以期为新药开发提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料及仪器

肺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞所。TGF-β1购自PeproTech；胎牛血清购自Gibco；RPMI-1640培养液购自吉诺生物医药技术有限公司；木犀草素购自Sigma；四甲基偶氮唑盐(MTT)和BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物公司；ECL超敏发光液购自Millipore；抗波形蛋白(vimentin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1MTT法检测细胞活力 取对数生长期细胞以5.0×107/L的浓度调整细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入体积100 μL，然后置37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，过夜待细胞贴壁后，加入不同浓度(5、10、20、40、80和160 μmol/L)的lu-teolin处理，以二甲基亚砜(DMSO)溶剂组为对照组，每个浓度设平行重复6孔。将细胞继续置于培养箱中培养24 h。弃培养板中的上清液，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL和80 μL无血清培养液，继续孵育4 h后，终止培养。最后，吸弃培养板中的上清，每孔加入150 μL DMSO，低速振荡5 min使结晶充分溶解，酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)值。实验重复3次。

2.2肺癌A549细胞EMT模型的建立 取对数生长期肺癌A549细胞，消化离心，调整细胞悬液约1×108/L，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入2 mL，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入含5 μg/L的无血清TGF-β1培养液，同时，以无血清不含TGF-β1培养液作为对照，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中继续培养24 h后，在倒置显微镜下观察细胞形态的变化。

2.3细胞侵袭实验 用无血清RPMI-1640培养液按1 ∶3稀释Matrigel基质胶，取50μL稀释后的Matrigel胶加入Transwell小室的上室中，置于37 ℃、5% CO2温箱培养1 h， 使基质胶凝固。用无血清培养液配制各组终浓度的药物，同时将TGF-β1诱导24 h的细胞用无血清的对应组药物制成8×107/L细胞悬液；取200 μL的含药细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养液，每组设置3个复孔，置于37 ℃、5% CO2细胞培养条件下培养24 h。取出小室，将上室液体弃去，用棉签头轻轻擦去上室未穿膜的细胞，磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline, PBS)漂洗后，甲醇固定30 min后，将Transwell 小室倒置自然风干。然后用0.1%结晶紫染色20 min，再用PBS清洗，在倒置显微镜下观察拍照，随机选取5个视野计数每孔穿膜细胞数，实验重复3次。

2.4Western blot法检测相关蛋白水平变化 采用5 μg/L的TGF-β1诱导肺癌A549细胞24 h，显微镜观察细胞形态改变，然后加入不同浓度的luteolin处理细胞24 h。用RIPA裂解液裂解提取诱导前后及干预前后各组细胞的总蛋白，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。取蛋白样品15 μg等量上样，经10% SDS-PAGE分离蛋白，利用湿法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，然后现配脱脂牛奶温室封闭1 h，将膜用TBST清洗后，分别加入鼠抗人E-cadherin、vimentin和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体室温摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，最后用ECL 化学发光试剂盒进行曝光，凝胶成像系统拍照，并分析条带灰度值。

3 统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。实验数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 木犀草素抑制肺癌A549细胞活力

MTT检测结果显示，与对照组相比，不同浓度(5、10、20、40、80和160 μmol/L)的luteolin对肺癌A549细胞存活力产生明显影响。随着luteolin给药剂量的增加和作用时间的延长，luteolin对肺癌A549细胞的生长抑制率显著上升(P<0.05)，见图1。 Luteolin作用肺癌A549细胞24 h的IC50为68.79 μmol/L，48 h的IC50为47.86 μmol/L。

2 肺癌A549细胞EMT模型的建立

在倒置显微镜下观察细胞形态，实验结果表明，与未经TGF-β1处理的对照组细胞比较，经TGF-β1诱导肺癌A549细胞24 h后，其细胞形态由多边形向成纤维样细胞形态改变，见图2A。Western blot法检测结果显示，经TGF-β1诱导肺癌A549细胞24 h后，EMT分子标志物E-cadherin蛋白表达水平显著下调，而vimentin蛋白分子表达显著上调 (P<0.01)，见图2B。

Figure 1.The effects of luteolin on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

图1 不同浓度的木犀草素对肺癌A549细胞活力的影响

Figure 2.TGF-β1 induced EMT in routinely cultured lung cancer cell line A549. A： the morphological changes of A549 cells observed under microscope (scale bar=50 μm); B: the protein expression of E-cadherin and vimentin determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

图2 TGF-β1诱导细胞EMT模型的建立

3 木犀草素抑制由TGF-β1诱导的肺癌A549细胞侵袭

Transwell小室侵袭实验结果显示，经TGF-β1作用肺癌A549细胞后，肺癌A549细胞的侵袭能力较未经TGF-β1作用组处理的细胞显著增强 (P<0.01)；但是，与TGF-β1作用组细胞相比，随着luteolin浓度的增加，肺癌A549细胞的侵袭能力显著下降(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The invasion ability of A549 cells treated with luteolin was examined by Transwell assay. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

图3 Transwell小室法检测木犀草素对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

4 木犀草素逆转TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT

经TGF-β1刺激24 h的肺癌A549细胞，在显微镜观察下由多边形向成纤维样细胞形态改变，而加入luteolin作用后，其细胞形态向多边形改变，见图4A。 Western blot法检测luteolin对EMT标志物E-cadherin和Vimentin的影响，实验结果显示，与对照组相比，TGF-β1作用组显著下调肺癌A549细胞E-cadherin 蛋白表达水平，同时上调vimentin蛋白表达水平(P<0.01)；然而，加入不同浓度的luteolin处理后，与TGF-β1作用组相比较，肺癌A549细胞E-cadherin 蛋白表达水平上调，而vimentin蛋白表达水平下调(P<0.01)，见图4B。

讨 论

肺癌是我国发病率和死亡率极高的恶性肿瘤。晚期肺癌患者的预后与侵袭转移密切相关，肿瘤一旦发生转移，便在肺癌的治疗中就非常棘手。肺癌的转移受多种因素的影响，其具体机制仍不清楚。EMT与肿瘤细胞的侵袭和迁移过程有着密切的联系。近年来针对EMT抑制剂的研究已成为抗癌药物研究的重要方向。

木犀草素是从天然植物中提取的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。Luteolin对不同的肿瘤如肝癌[3]、胃癌[6]、前列腺癌[4]和肺癌[5]等发挥抗癌作用。文献报道的抗肿瘤作用机制复杂，如luteolin通过抑制MAPK和PI3K信号通路抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[8]。Luteolin发挥抗肿瘤作用与免疫调节以及抑制血管生成有关[9]。文献报道，luteolin可增加抗癌药物的敏感性，降低肿瘤细胞多药耐药[10-11]。最近研究显示， 木犀草素通过抑制Notch信号通路逆转EMT的发生，从而有效抑制胃癌生长[12]；木犀草素通过逆转EMT的发生抑制乳腺癌转移[13]。由此可见，抑制EMT的发生作为一种新的抗肿瘤机制，通过阻止癌细胞的侵袭和转移在胃癌和乳腺癌等多种癌症中已被证实。然而，luteolin对肺癌EMT影响的文献报道较少，生长因子例如HGF、EGF和TGF均可诱导EMT的发生，尤其是TGF-β1诱导肿瘤细胞的EMT作用为较明显，因此，本文将重点阐述luteolin对TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT的影响。

Figure 4.Morphological changes of A549 cells after luteolin treatment and the protein levels of E-cadherin and vimentin in TGF-β1-induced A549 cells treated with luteolin. A： the morphological changes of A549 cells observed under microscope (scale bar=50 μm)； B： the protein expression of E-cadherin and vimentin determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group.

图4 木犀草素对TGF-β1诱导的A549细胞形态变化和EMT相关蛋白E-cadherin及vimentin表达水平的影响

当肿瘤细胞发生EMT后，其细胞表型发生改变，例如，促进细胞间黏附的上皮表型标志蛋白E-cadherin表达下调，促进肿瘤发生侵袭和转移的间充质表型标志蛋白vimentin表达逐渐增高，从而使细胞的迁移和侵袭能力增强[14-15]。因此，阻断EMT的发生是限制肿瘤细胞扩散的有效治疗方法。本研究首先通过TGF-β1诱导肺癌A549细胞建立EMT模型，结果显示，经TGF-β1处理后大部分细胞形态由多边形向成纤维样细胞形态改变；同时，EMT相关的标志蛋白， E-cadherin蛋白表达水平下调，vimentin蛋白表达水平上调，与细胞形态的变化结果相一致。Luteolin可逆转TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT的发生，不仅从形态学上使其恢复上皮细胞的不规则多边形，其EMT相关蛋白 E-cadherin和vimentin 表达均得到逆转。这些结果和张彦兵等[2]报道白花蛇舌草总黄酮对TGF-β1诱导的肝癌细胞EMT具有逆转作用中的EMT模型结果相符。经历EMT的细胞最重要的行为改变是细胞侵袭能力的增强，本研究结果显示，TGF-β1组A549细胞穿过人工基膜的细胞数较对照组显著增多，细胞侵袭率增加，说明发生EMT使肺癌A549细胞的侵袭能力增强，而luteolin处理可使细胞侵袭率显著降低，表明luteolin可以抑制肺癌A549细胞EMT引起的细胞侵袭能力增强。这可能与上皮细胞因子E-cadherin 表达增多有关，因为E-cadherin使细胞间相互黏附聚集，不易向远处扩散。

综上所述，本实验通过细胞形态的改变及EMT标志蛋白的变化初步表明luteolin作为一种天然存在的化合物可逆转由TGF-β1诱导的肺癌A549细胞的EMT，为luteolin在肺癌中的应用提供了参考资料。