中药方剂赤白汤对D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰竭小鼠肠道菌群的影响研究*

张 璇，唐小云，唐春银，石学魁，王惠琦，张晓东，沈海萍，杨春辉

作者单位:157011黑龙江省牡丹江市 牡丹江医学院附属红旗医院感染病科（张璇，杨春辉，王惠琦，张晓东，沈海萍）；牡丹江医学院（唐小云，唐春银，石学魁）

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是指各种原因引起肝细胞大面积坏死或严重肝功能损害，出现以黄疸、腹水、肝性脑病和凝血功能障碍等为主要表现的一种临床综合征[1-6]。目前，我国的ALF主要以病毒性肝炎、药物性肝损害为主，且发病率逐年增加。ALF的发病机制复杂，菌群紊乱和内毒素血症在ALF的发病过程中起着重要的作用[7，8]。ALF个体肠道黏膜屏障受损，肠腔内有害物质如细菌和毒素就会穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环。我们研究的中药方剂赤白汤是由白术、白芍、赤芍熬制而成，其中白术主要含有白术内酯和挥发油等成分，具有调节胃肠道运动，改善消化道功能的功效[9]；白芍主要含芍药苷和内酯苷等多种化学成分，具有护肝、抗炎、止痛等功效[10]；赤芍主要含黄酮类、萜类等，具有护肝、抗氧化、抗内毒素等功效[11]。本实验采用D-氨基半乳糖/脂多糖诱导ALF小鼠，观察了中药方剂赤白汤对动物肠道菌群的影响，以期为ALF临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、试剂和仪器 清洁级昆明小鼠48 只，雌雄各半，6～8 周龄，体质量 25～30 g，由哈尔滨医科大学提供。白术、白芍、赤芍（本院），丽珠肠乐胶囊（珠海市丽珠集团），D-氨基半乳糖（上海源叶公司），脂多糖（美国Sigma公司），Oxoid酵母粉（上海根生生物科技有限公司），冰乙酸（天津北方天医化学试剂厂），吐温80（宝泰克生物科技公司），无菌均质袋、2.5 L厌氧产气包、EMB琼脂、肠球菌琼脂、LBS琼脂、BS琼脂（青岛海博生物技术有限公司），YXQ-LS-30SⅡ全自动立式压力蒸汽灭菌锅和超净工作台（上海博讯实业有限公司），电热恒温培养箱（常州恒德仪器制造有限公司），台式高速离心机（德国Eppendorf），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），正置显微镜（日本尼康有限公司），培养皿（江苏新康医疗器械有限公司），干热灭菌器（日本SANYO），恒温水浴锅（江苏金坛医疗仪器厂），全自动生化分析仪（日本日立公司）。

1.2 中药方剂赤白汤的制备 根据人与动物体表面积折算法，按照（1：1：1.5）熬制，首先将药物粉碎为细末，均匀混合，然后加10倍体积蒸馏水浸泡60 min，再煮沸30 min，共煎药2次，合并2次药液，65℃水浴浓缩成每mL含1 g生药的药液，4℃冷藏保存备用。

1.3 ALF模型构建 随机将48只小鼠分为正常组、模型组、大剂量、中剂量和小剂量中药组，和丽珠肠乐组，每组8只。造模前8 d，在干预组，分别给予中药 20 g·kg-1、10 g·kg-1和 5 g·kg-1或丽珠肠乐（用生理盐水稀释成 0.2亿活菌/ml）0.5 ml或生理盐水0.5 mL灌胃，1次/d。然后，给予一次性腹腔注射D-氨基半乳糖（600 mg·kg-1）和脂多糖（20 μg·kg-1）诱导 ALF 小鼠模型。8 h后，采用颈椎脱臼法处死动物。取肝脏，称取肝脏质量，根据公式计算小鼠肝脏指数，即肝脏指数（%）=肝脏质量（g）/体质量（g）×100%。取小鼠肝右叶组织，置于10%中性福尔马林溶液中固定18 h，常规脱水、包埋、HE染色，于光镜下观察肝组织病理学变化。

1.4 血清ALT检测 采用摘除眼球法取血，离心留取血清，使用全自动生化分析仪检测ALT水平。

1.5 肠道菌群检测 在实验结束时，处死小鼠，于解剖板上进行常规消毒，沿腹中线切开腹腔，在无菌操作条件下取出结肠部粪便0.1 g，置于无菌均质袋中，加入0.05%无菌酵母液9.9 ml，人工拍打使粪便均质化，再用0.05%无菌酵母液对粪便进行10倍系列稀释，直至稀释至10-9倍。选择3个稀释度样品，每个10 μl，滴加到相应的培养基上，每个稀释度设3个培养基。采用平板活菌计数法计数菌落数，同一稀释浓度取均值（x）。根据公式，计算每一个培养基的菌落数，即菌落形成单位（clonal formation unit，CFU）/克标本 =x×100×稀释倍数。1.6统计学分析 应用SPSS 22.0软件行数据分析，计量资料以（±s）表示，多组样本均数的两两比较采用ANOVA分析（方差齐时，采用LSD-t检验，方差不齐时，采用Games-Howell法），P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学改变情况 模型组小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞索消失，有多处出血坏死灶，并有大量的炎性细胞浸润；大剂量中药组小鼠肝小叶结构紊乱，有大量出血坏死灶；中剂量中药组和小剂量中药组小鼠可见肝小叶结构较模型组排列稍整齐，细胞肿胀、坏死和出血减轻；丽珠肠乐组可见大量出血坏死灶（图1）。

2.2 各组血清ALT水平和肝指数变化 见表1。

2.3 肠道菌群 与正常组比，模型组大肠杆菌、肠球菌显著增高（P＜0.01，P＜0.001），乳酸杆菌、双歧杆菌显著降低（P＜0.001，P＜0.001）；大剂量组大肠杆菌、肠球菌显著增高（P＜0.05，P＜0.01），乳酸杆菌、双歧杆菌显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；小剂量组乳酸杆菌、双歧杆菌显著降低（P＜0.05，P＜0.05）；丽珠肠乐组乳酸杆菌显著降低（P＜0.05）。与模型组比，大剂量组双歧杆菌显著增高（P＜0.05）；中剂量组大肠杆菌、肠球菌显著降低（P＜0.01，P＜0.001），乳酸杆菌、双歧杆菌显著增高（P＜0.001，P＜0.001）；小剂量组大肠杆菌、肠球菌显著降低（P＜0.05，P＜0.01），乳酸杆菌、双歧杆菌显著增高（P＜0.05，P＜0.05）；丽珠肠乐组大肠杆菌、肠球菌显著降低（P＜0.05，P＜0.01），乳酸杆菌、双歧杆菌显著增高（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

图1 各组肝组织病理学改变（HE，100×）

表1 各组小鼠血清ALT水平和肝指数（±s）比较

表1 各组小鼠血清ALT水平和肝指数（±s）比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

ALT（U/L） 肝指数（%）正常组 8 36.9±7.5 5.2±0.3模型组 7 1983.3±629.0① 6.7±0.6①大剂量中药 7 1373.5±306.7② 5.8±0.7①中剂量中药 8 230.8±71.7①② 5.5±0.6②小剂量中药 8 676.7±202.8①② 5.7±0.6②丽珠肠乐 8 490±119.7①② 6.0±0.5①只

表2 各组小鼠肠道菌群数量（lgCFU/粪便，±s）比较

表2 各组小鼠肠道菌群数量（lgCFU/粪便，±s）比较

与正常组比，①P＜0.05；与模型组比，②P＜0.05

只 大肠杆菌正常组 8 7.6±0.9模型组 7 8.7±0.5①大剂量中药 7 8.3±0.6①中剂量中药 8 7.6±0.4②小剂量中药 8 8.0±0.2丽珠肠乐 8 8.0±0.3②肠球菌8.8±0.2 9.5±0.3①9.2±0.2①8.9±0.3②9.1±0.2 9.1±0.2乳酸杆菌10.4±0.5 9.3±0.3①9.7±0.6 10.2±0.7②9.9±0.3 9.9±0.4双歧杆菌11.2±0.5 10.1±0.4①10.7±0.6①②11.1±0.3②10.7±0.4 11.0±0.3②

3 讨论

ALF临床表现包括肝功能异常、凝血功能紊乱、肝性脑病等，在某些情况下，一些没有肝病病史的患者可出现多器官衰竭[11]。目前，ALF的治疗主要是一般支持治疗，如针对病因治疗、调节免疫功能治疗以及防治并发症的治疗。最新的治疗方案包括肝脏移植、生物人工装置分子吸附再循环系统（MARS）、干细胞移植治疗等[12-15]。ALF的治疗主要是西药治疗，而中药在我国有着广泛的临床应用，将中药运用于ALF的治疗有着广阔的应用情景。

本实验采用腹腔注射D-氨基半乳糖/脂多糖成功建立了ALF模型。与正常组比，模型组肝组织有多处出血、坏死，并有大量的炎性细胞浸润，血清ALT水平明显增高，肝脏指数明显增高，肠道内大肠杆菌、肠球菌数量明显增多，而乳酸杆菌、双歧杆菌数量明显减少，说明模型组小鼠肝脏损伤严重并出现了肠道菌群紊乱。分别给予大、中、小剂量中药灌胃，与模型组比，小、中剂量中药组肝组织病理性出血、坏死较模型组减轻，且中剂量中药组比小剂量中药组肝脏损伤减轻更明显。与模型组比，小、中剂量中药组动物血清ALT水平显著降低，且中剂量中药组动物血清ALT水平比小剂量中药组下降明显。与模型组比，小、中剂量中药组肠道粪便大肠杆菌和肠球菌显著降低，而乳酸杆菌和双歧杆菌显著增高，证明中药方剂赤白汤对ALF有一定的干预作用，且中剂量中药组比小剂量中药组效果好，而大剂量中药组动物血清ALT水平、肝组织损伤、肝脏指数改善没有中剂量中药组明显，且对肠道有害菌的调节作用与模型组相比也无统计学差异，证明中药方剂赤白汤并非随着中药浓度的增加效果增加，而中药最适浓度在5 g·kg-1（小剂量）～10 g·kg-1（中剂量）之间。

胃肠道是人体最大的细菌存储库，胃肠道内的微生物群对宿主的健康起着重要的作用[16]。当机体处于健康状态时，肠道内细菌的种类和数量相对稳定，有利于机体的消化吸收，还能抵御一些病原菌通过肠道侵入体内，是机体免疫系统不可缺少的重要组成部分[17]。当机体的肠道菌群紊乱时，肠道内菌群可能发生易位，甚至会引发内毒素血症，而内毒素血症是引起ALF的诱发因素之一，因而会加重病情[18-20]。因此，重视胃肠道功能在ALF发展中的作用，早期防止胃肠道功能紊乱，可以防止病情恶化，对改善ALF病情有重要意义，这也为中药方剂赤白汤的临床运用提供了理论依据。本实验表明中药方剂赤白汤可以促进肠道优势菌的增长、抑制有害菌的生长、减少菌群易位、进而有利于改善肝功能。中药方剂赤白汤对肝脏的保护作用可能与其能够调节ALF引起的肠道菌群紊乱有关。