去甲斑蝥酸钠对肝癌异位移植瘤小鼠肠道微生态的影响初探*

裴 颖，黄 峰，殷宏振，郭化磊

作者单位:712000陕西省咸阳市陕西中医药大学第一临床医学院

去甲斑蝥酸钠作为疗效确切的抗肿瘤药物被广泛应用于动物实验和临床研究[1-4]，比如它能通过TRAIL/DR5信号诱导人肝癌细胞Hep3B凋亡[5-7]。本研究应用去甲斑蝥酸钠处理肝癌异位移植瘤小鼠，观察了肠道微生态的变化，初步探究了去甲斑蝥酸钠对肝癌异位移植瘤小鼠肠道微生态的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂与仪器 昆明小鼠12只，体质量（25 2）g，雌雄不限，分笼饲养，室温保持在 20～25℃，湿度为45%～55%。所有实验动物和饲料均购自西安交通大学实验动物中心[许可证号:SCXK（陕）2012-003]。H22肝癌肿瘤细胞悬液（陕西中医药大学实验室制备）。去甲斑蝥酸钠注射液（四川升和药业股份有限公司）。Buffer缓冲液、蛋白酶?K和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（上海微基生物有限公司）。L9600A Thermal Cycler（北京莱普特科学仪器有限公司）；TG16G台式高速离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司）；UV5-Nano超微量紫外分光光度计（上海柏辰生物科技有限公司）；Invitrogen Qubit Spectrophotometer（上海元析仪器有限公司）；FTC-3000TM real-time PCR仪（Thermo Fisher Scientific Company）。

1.2 肝癌异位移植瘤小鼠模型的制备 将12只小鼠随机分为去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组，每组各4只。在无菌条件下，将制备好的H22肝癌肿瘤细胞悬液以0.2 ml/只的剂量接种于昆明小鼠左前肢腋下，复制H22肝癌异位移植瘤小鼠模型。其中去甲斑蝥酸钠注射液组和生理盐水处理组分别给予去甲斑蝥酸钠0.1 mg·kg-1、生理盐水0.2 ml/只腹腔注射，隔日1次，而对照组不给予任何干预[16]。给予动物标准饮食饲养2 w，于第15 d处死小鼠，并解剖采集肠道粪便，置入含有Buffer缓冲液的EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3 基因组DNA提取 取预处理的粪便，解冻，以15000 r/m离心，收集沉淀。按照QIAamp DNA Stool Mini Kit步骤进行DNA提取，并利用UV5-Nano超微量紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质检。

1.4 PCR扩增及样品定量 根据Illumina miseq高通量测序要求，完成特异性引物的设计。forwards primer：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物-3’；reverse primer:5’-CAAGC AGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物-3’。采用两步PCR扩增法，首先采用特异引物（内侧引物）扩增目的片段，将目的片段行胶回收，再将回收产物作为模板进行二次PCR扩增。将PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳、切胶，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收，将回收产物在FTC-3000T Mreal-time PCR仪行样本定量，并将样品按照等摩尔比混匀后，制备文库，测序。

1.5 统计学分析 根据Miseq测序得到PE reads区分样本，再用overlap关系得到的优化序列对操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）进行多样性指数分析，如alpha多样性分析，和群落结构的统计分析，如beta多样性分析。在上述分析的基础上，进行一系列群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析，并通过anova-t test参数分析比较去甲斑蝥酸钠注射液、生理盐水处理组和对照组组间差异，筛选出P＜0.05差异显著的菌群。

2 结果

2.1 基本情况 8只异位移植瘤小鼠种瘤成功，瘤径为（11.78 3.26）mm。在12只小鼠取得粪便，每个样本测序条数约为30 000个。

2.2 基于OTU分析的结果

2.2.1 稀释性曲线 结果显示，各样本稀释性曲线均趋向于平坦（图1），表明测序数据量合理。

2.2.2 丰图等级图 结果显示，各样本丰图等级曲线水平方向逐渐增宽，表示物种丰度高，而各样本丰图等级曲线趋于平缓（图2），表明物种分布均匀。

图1 释线性曲线模式图

2.3 群落结构组成图 去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组粪便菌群组成在门水平和属水平上的分部情况见图3和图4。

图2 丰图等级图

2.4 多组间物种差异比较 根据anova_oneway分析结果显示，门水平和属水平上P值小于0.05（即差异显著）的菌群分部情况见图5和图6。

图3 门水平物种分布柱状图

图4 属水平物种分布柱状图

图5 三组菌群门水平差异性比较

图6 三组菌群属水平差异比较

2.5 本研究结果分析

2.5.1 基于OTU结果的分析 通过对释线性曲线和丰度等级图结果分析，各测序样本数据量合理，所包含物种量丰富，各组样本在物种丰富度和均匀度上趋于一致，满足进一步对各样本群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析的要求。

2.5.2 基于物种群落结构组成和多组间物种差异比较 去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组菌群组成在门水平和属水平上存在差异，其中差异显著（P＜0.05）的菌群结果见表1。根据多组间物种差异比较结果和各样本物种群落结构组成比例数据处理后可知，去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组有显著差异的菌群（P＜0.05）在门水平和属水平上（以变形菌门和拟杆菌属为比较对象）所占比例情况见表2。总之，去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组在群落结构组成上存在显著差异；在门水平上，三组之间差异最显著的菌群为变形菌门，其中去甲斑蝥酸钠注射液组变形菌门所占比例最高；在属水平上，三组之间差异最显著的菌群包括拟杆菌属和衣原体属等，其中生理盐水处理组变形菌属所占比例最高。

表1 三组差异显著的菌群结果

表2 三组菌群中变形菌门和拟杆菌属所占比例（%）比较

3 讨论

去甲斑蝥酸钠在临床上已证实可以抑制癌细胞增殖[8-11]。在关于去甲斑蝥素抗肿瘤的机制研究中发现，去甲斑蝥素可以阻断肝癌细胞发生周期，从而诱导肝癌细胞的凋亡。同时，去甲斑蝥素还可以增强机体免疫功能，抑制肝癌细胞的侵袭和转移[12-14]。本实验经去甲斑蝥酸钠注射液处理，H22肝癌异位移植瘤小鼠肠道菌群在门水平和属水平上均发生了显著的改变，可能与去甲斑蝥酸钠在发挥抗肿瘤活性的过程中抑制肝癌细胞增殖，从而阻断TLR通路，抑制或减少LPS水平，改善肠道微环境，从而出现肠道菌群特异性的改变有关。也可能与去甲斑蝥酸钠增强肝癌小鼠免疫功能，修复黏膜屏障，改善炎症反应，减少肠道内毒素，从而出现肠道菌群特异性改变有关。

此次实验发现，去甲斑蝥酸钠注射液组、生理盐水处理组和对照组粪菌在属水平上的拟杆菌属存在特异性的改变。拟杆菌属为革兰氏阴性菌，是一种条件致病菌，往往会在免疫机能紊乱的情况下释放和分泌大量的肠源性毒素和内毒素，共同导致肠道菌群失调，肠黏膜屏障受损，通过门静脉系统进入肝脏直接造成肝脏的损伤和癌变[5-18]。未经造模的小鼠，即在对照组，粪便中所含拟杆菌属比例较低，造模后的小鼠（生理盐水处理组）粪便中拟杆菌属比例显著升高，而经药物干预后的小鼠（去甲斑蝥酸钠注射液组）粪便中拟杆菌属比例又有了明显的下降。由此我们推测，拟杆菌属在HCC的发生、发展中存在特异性的改变。但拟杆菌属能否作为HCC在肠道微生态中的特异性标志物，是否可以通过对肠道菌群中的拟杆菌属进行靶向干预作为治疗HCC的一个新途径，尚待更多的实验研究证实。

研究表明，通过调节肠道菌群失衡情况可以有效抑制HCC的发生发展。CTLA-4在发挥抗肿瘤作用时必须依赖肠道菌群。当肠道菌群缺失时，CTLA-4则无法有效地发挥抗肿瘤作用。益生菌可以提高机体免疫功能，加快机体能量代谢，有效抑制肿瘤的生长。以上研究结果表明，益生菌在抑制肿瘤生长方面有确切的效果，可能与益生菌能够增加肠道酸性、调节肠道免疫功能、抑制酪氨酸激酶信号通路等有关。目前，改善肿瘤患者全身情况疗效确切的益生菌有双歧杆菌、乳酸菌、鼠李糖乳杆菌和部分益生菌混合制剂，如鼠李糖乳杆菌与费氏丙酸杆菌混合制剂等。不过，通过调节肠道微生态防治HCC还缺乏多中心的临床试验的验证。