醋酸环丙孕酮有关物质和含量测定方法研究

安 彦，王 卫

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

醋酸环丙孕酮为一种抗雄激素药物，可抑制雄激素的作用，并表现出孕激素和抗促性腺激素的作用。临床中醋酸环丙孕酮常与炔雌醇制成复方制剂，或与盐酸吡格列酮、醋酸亮丙瑞林等药物联合使用，适应症包括：自身免疫性孕酮皮炎、功能性子宫出血、多囊卵巢综合症及子宫内膜异位等病症的治疗[1-4]。经查询，目前该品种尚未收入《中国药典》，国内质量标准收载于《国家药品标准新药转正标准》第90册，标准号为WS1-(X-040)-2010Z(以下简称国标)。现行国外药典中，《美国药典》第44版(USP 44版)未收载该品种，《英国药典》2018版(BP 2018)及《欧洲药典》9.4版(EP 9.4)均有收载。本次研究在比对国内外现行质量标准和方法基础上[5-7]，优化试验条件，使有关物质和含量测定方法更具合理性和有效性，增强方法的可控性。经国家药品监督管理局网站查询，我国醋酸环丙孕酮的生产企业有湖北葛店人福药业有限公司、浙江仙琚制药股份有限公司及上海创诺制药有限公司，共三家企业，本次试验样品来自前两家企业。

1 仪器与试药

Agilent 1100色谱工作站；Waters e2695色谱工作站；METTLER XSE205DU天平；色谱柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)；Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Waters C18柱(125 mm×4.6 mm,3 μm)；乙腈为Merck色谱纯；水为纯化水；醋酸环丙孕酮对照品(批号10053-201602；纯度99.7%)、醋酸甲羟孕酮对照品(批号100001-201305，纯度99.6%)均来自中国食品药品检定研究院，醋酸环丙孕酮杂质对照品(EP对照品，含杂质F和杂质I，批号Y0001223)、醋酸环丙孕酮杂质定位对照品(EP对照品，批号Y0001390)、醋酸地马孕酮对照品(进口对照品，Trc-canada公司，批号1-CHG-104-2)；醋酸环丙孕酮样品分别由浙江仙琚制药股份有限公司(样品编号1、2)和湖北葛店人福药业有限公司(样品3、4、5)提供。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用Phenomenex C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)，以乙腈-水(45∶55)为流动相，检测波长为254 nm，柱温为40 ℃，进样体积为20 μl。

2.2溶液制备

2.2.1有关物质溶液 取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中含2 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.2.2含量测定溶液 精密称定本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中约含0.2 mg的溶液，作为含量测定供试品溶液；另取醋酸环丙孕酮对照品适量，精密称定，同法制备，作为对照品溶液。

2.3系统适用性试验 称取醋酸地马孕酮对照品约5 mg，置25 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，量取5 ml，加流动相稀释至50 ml，摇匀，量取1 ml，加入已称取醋酸环丙孕酮约20 mg的10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。色谱图中醋酸环丙孕酮与醋酸地马孕酮的分离度为2.5，见图1。

1.醋酸地马孕酮(杂质Ⅴ) 2.醋酸环丙孕酮图1 系统适用性试验色谱图

2.4线性试验

2.4.1有关物质线性试验 精密称取醋酸环丙孕酮对照品适量，加乙腈溶解并稀释成每1 ml中含5 mg的溶液，作为对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液适量，分别加流动相稀释制成浓度为0.4、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0和30.0 μg/ml的系列溶液，分别精密量取上述溶液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图；以醋酸环丙孕酮的浓度为横坐标(C)，以相对应的峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归。结果表明：醋酸环丙孕酮自身对照溶液在0.4～30.0 μg/ml的浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系，其线性方程为A=22.16C+0.227(r=0.999 99，n=7)。

2.4.2含量测定线性试验 精密称取醋酸环丙孕酮对照品约20 mg，加流动相溶解并稀释至50 ml，作为对照品贮备溶液；精密量取对照品贮备溶液适量，分别加流动相稀释制成浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.40 mg/ml的系列溶液，分别精密量取上述溶液20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图；以醋酸环丙孕酮的浓度为横坐标(C)，以相对应的峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归。结果表明：醋酸环丙孕酮供试液在0.05～0.40 mg/ml的浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系，其线性方程为A=22.43C-45.16(r=0.999 99，n=7)。

2.5最低检出限(灵敏度试验) 精密量取对照溶液适量，采取逐步稀释法测定，在与有关物质供试品溶液及对照溶液相同的标尺下记录色谱图，经试验，溶液浓度稀释至自身对照溶液浓度的0.02倍时，主峰可清晰分辨，主峰信噪比为12。

2.6精密度试验

2.6.1有关物质精密度 取供试液和对照溶液，按“2.1”项下方法测定，计算连续6针对照溶液主峰、供试液主峰、单杂及总杂的RSD，结果依次为0.77%、0.27%、0.96%和1.16%，表明精密度良好。

2.6.2含量测定精密度 按“2.2.2”项下方法制备供试液和对照品溶液，按“2.1”项下方法测定，计算连续6针供试液和对照品溶液主峰的RSD，结果分别为0.3%和0.1%，表明精密度良好。

2.7重复性试验

2.7.1有关物质重复性试验 取同一批号醋酸环丙孕酮样品分别称取6份，按“2.2.1”项下方法制备供试液，按“2.1”项下方法测定，计算6份供试液中杂质Ⅰ、单杂及总杂结果的RSD依次为7.3%、0.9%和1.9%，表明重复性良好。

2.7.2含量测定重复性试验 取同一批号醋酸环丙孕酮样品分别称取6份，按“2.2.2”项下方法制备供试液，按“2.1”项下方法测定，计算6份供试液含量的RSD，结果为0.3%，表明重复性良好。

2.8溶液的稳定性试验 取有关物质对照溶液及供试品溶液在室温下分别放置44和32 h，期间分别测定5个不同时间点的溶液稳定性，计算对照溶液主峰面积、供试液主峰面积、单杂峰面积及总杂峰面积的RSD，试验结果表明，对照溶液在44 h内、供试品溶液在32 h内稳定。另取含量测定对照品溶液及供试品溶液在室温下放置27 h，期间分别测定5个不同时间点的溶液稳定性，计算对照品溶液主峰面积和供试液主峰面积的RSD，试验结果表明对照品溶液和供试品溶液在27 h内稳定。

2.9准确度试验 取5批醋酸环丙孕酮样品，按“2.2.2”项下方法制备供试液，按“2.1”项下方法测定，计算含量。再取上述样品按照现行质量标准(国标)进行测定，经比较，两种方法的测定结果一致，方法准确，结果见表1。

表1 方法准确度结果

2.10破坏试验

2.10.1酸破坏 精密称取本品约0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L盐酸溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L氢氧化钠溶液至中性，转移并加流动相至100 ml。经与醋酸环丙孕酮混合杂质对照品及醋酸环丙孕酮杂质定位对照品比对，主要降解产物的保留时间与杂质Ⅲ和杂质Ⅵ一致，见图2。

2.10.2碱破坏 精密称取本品约0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氢氧化钠溶液15 ml常温放置过夜，经比对，主要降解产物的保留时间及光谱图与杂质Ⅲ一致，见图2。

2.10.3氧化破坏 精密称取本品约0.2 g，置100 ml量瓶中，加乙腈15 ml使溶解，加入过氧化氢浓溶液15 ml，放置过夜，加流动相至刻度，结果表明主峰可降解出未知杂质，见图2。

2.10.4光照破坏 精密称取本品约0.1 g，加流动相溶解并稀释至50 ml，经4 500 lx光照72 h后测定，未发生明显变化，见图2。

2.11已知杂质的命名和定位 按照EP 9.4(BP 2018)，有关物质混合杂质对照品中含有杂质F和杂质I，杂质定位对照品中含有杂质B、杂质C、杂质E和杂质G，本次研究工作制备了醋酸环丙孕酮及6个已知杂质对照品的混合溶液，采集图谱(见图3)并重新计算了已知杂质的相对保留时间，根据《中国药典》的命名习惯，按杂质出峰顺序依次命名为杂质Ⅰ～杂质Ⅵ，详见表2。

表2 已知杂质对照表

1.未知杂质 2.杂质Ⅲ 3. 醋酸环丙孕酮 4.杂质Ⅵ图2 酸破坏(A)碱破坏(B)氧化破坏(C)光照破坏(D)未破坏样品(E)HPLC色谱图

2.12样品测定和耐用性试验 取5批样品分别采用Agilent 1100色谱工作站、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)色谱柱和Waters e2695色谱工作站、Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱照“2.1”项下方法试验测定有关物质和含量，5批样品采用不同仪器、不同类型色谱柱试验，结果基本一致，结果见表3和表4。

1. 杂质Ⅰ 2. 杂质Ⅱ 3. 杂质Ⅲ 4. 杂质Ⅳ 5. 杂质Ⅴ 6.杂质Ⅵ图3 醋酸环丙孕酮及已知杂质Ⅰ～杂质Ⅵ混合溶液色谱图表3 样品有关物质测定及耐用性试验结果

样品编号有关物质测定结果(%)杂质Ⅰ单杂总杂耐用性试验结果(%)杂质Ⅰ单杂总杂10.0130.080.110.0180.070.1120.0150.080.120.0180.070.1230.110.060.330.110.050.3440.090.030.230.100.020.2250.090.030.230.090.030.22

表4 样品含量测定及耐用性试验结果

3 讨论

3.1本次醋酸环丙孕酮质量研究工作主要是在国标和《欧洲药典》的方法基础上对色谱系统进行了优化。其中国标方法系统适用性试验醋酸甲羟孕酮与醋酸环丙孕酮的分离度应大于3.0，仅控制杂质总量；而EP 9.4(BP 2018)有关物质方法分别采用了混合杂质对照品(含有杂质F和杂质I)和杂质定位对照品(含有杂质B、杂质C、杂质E和杂质G)，对上述已知杂质的定位采用了两种混合杂质对照品结合相对保留时间的方式。国标方法的分离度较差，无法将已知杂质完全分离。EP 9.4的测定方法可将6个已知杂质与主峰完全分离，但需要使用特殊型号色谱柱(C18，125 mm×4.6 mm，3 μm)且分析时间过长；而本品的已知杂质对照品国内尚无法生产，购买周期长，价格极其昂贵，不适用于常规检验。经修订后的色谱系统仅用普通C18柱即可实现醋酸环丙孕酮及6个已知杂质对照品的完全分离，通过所采集的主峰和已知杂质对照品色谱图及相对保留时间实现对已知杂质的定位。

3.2在进行碱破坏试验中，首先选择精密称取本品约0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氢氧化钠溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L盐酸溶液至中性，转移并加流动相至100 ml，结果主峰被完全降解。在多次调整破坏条件后发现，本品在碱性条件下极不稳定，常温放置5 min即可发生降解，经比对，主要降解产物的保留时间及光谱图与杂质Ⅲ一致，提示本品对碱性条件极不稳定。