基于DNA条形码技术的新疆民族药材天山堇菜基原研究＊

樊丛照，朱 军，赵亚琴，王果平，李晓瑾

（新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，国家中医药管理局新疆中药民族药资源重点实验室 乌鲁木齐 830002）

民族药材天山堇菜，又称“比乃非谢”，系堇菜科多年生草本植物天山堇菜（西藏堇菜）Viola kunawarensis的干燥全草，具有清热解毒、消炎退烧、润肺消肿、润肺止咳、通利二便等功效，是降热比那甫西糖浆、益脑吾斯提库都斯糖浆等4种民族药成药制剂的主要成分[1-3]。现市场流通的天山堇菜药材基原不清，药材形态各异，各执一词，难辨真伪，严重影响相关药品质量控制和应用。然而，堇菜属植物变异复杂，种间存在杂交，分类相当困难，各学者对于堇菜属属下的系统发育关系意见并不统一[4-6]，所以，仅采用传统形态学方法鉴定市售天山堇菜药材的基原极为困难，制约了产业的发展。

准确的基原鉴定是保障药材质量的根本，因各种原因，民族药材质量控制及监管整体水平较低[7]，虽然已制定了3部地方标准，规定了200余种药材的基原，但由于民族药材的地域性、多外来种，基原不清仍然是制约药材应用与产业发展的关键，也使基于原植物特点的传统特性形态与性状鉴别相形见绌。DNA条形码技术，已被《中华人民共和国药典》2015版收载，ITS2及psbA-trnH序列作为候选序列，具有通用性强、鉴定结果可靠、重复性良好的特点，已应用于多种民族药材溯源研究[8-13]。本研究拟采用DNA条形码ITS2序列，为明确天山堇菜药材基原提供鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究中所使用的126份堇菜属植物样本采自新疆不同地区（表1），凭证标本保存于新疆大学标本馆（XJU）及新疆中药民族药研究所标本馆（新疆XTNM），“天山堇菜”药材样品采自新疆各地民族药材市场（表2）。

1.1.1 试剂

PCR扩增所用引物由上海生工生物工程有限公司合 成 ，ITS2 正 向 序 列 ：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向序列：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[14]；DNA 提取试剂盒（DP305-03）、2×Taq Master Mix等购自天根生物。

表1 实验材料信息

1.1.2 实验仪器

实验所使用的DNA提取研磨仪为GRINDER，型号GT-100；离心机为上海安亭科学仪器，型号Anker TGL-16C；PCR扩增仪为An Analytik Jena company，型号070-851。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及检测

称取干燥样品（茎叶）30 mg，DNA提取研磨仪1000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取试剂盒提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。

表2 天山堇菜药材样品信息

表3 实验结果

1.2.2 PCR扩增及测序

反应体积25 μL，dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），PCR缓冲液2.5 μL（10×），引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），聚合酶1.0 U，总DNA 1 μL（约30 ng）。引物ITS2扩增程序：94℃，变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（40个循环）；72℃延伸10 min[14]。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测并纯化后，使用ABI 3730 XL（Applied Biosystems Co.,USA）测序仪由美吉生物测序公司进行双向测序。

1.3 数据处理

使用 CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.,USA）校对拼接测序结果，去除引物区。使用软件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比对结果[15]，基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法，去除ITS2序列两端5.8S和28S区段获得间隔区序列[16]，用邻接（NJ）构建系统聚类树，使用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率[17].

2 结果

2.1 PCR扩增及测序结果

从126份植物样本及18份药材样本中均成功提取了基因组DNA，PCR扩增及测序结果表明所有实验样本扩增成功，扩增结果质量满足测序要求，并获得了有效的双向测序结果。

2.2 基原植物及同属近缘种DNA条形码鉴定数据库的建立

使用基原植物天山堇菜及其同属17种植物的37条ITS2单倍型序列建立DNA条形码鉴定数据库（表3），数据库中的ITS2序列特征如表4所示，天山堇菜15个样本为1个单倍型，ITS2序列长度为210 bp，GC含量为67.6%。天山堇菜近缘种17种植物36条ITS2序列单倍型长度为210-222 bp，GC含量变化范围为60.6%-67.1%（平均64.4%），共有72个变异位点，种间平均K2P距离为0.115（0-0.229）。

2.3 市售药材鉴定结果

从市场中获得的民族药材天山堇菜ITS2序列为210-236 bp，GC含量变化为62.2%-69.1%（平均66.3%），序列间存在109个变异位点，源于多种植物。基于ITS2序构建的NJ鉴别树表明（图1），不同来源的天山堇菜药材样品分别聚为5类，其中编号为YCT03008、YCT03016、YCT03018的药材样品与天山

堇菜聚为一支，药材YCT03005-06、YCT03010与香堇菜聚为一支，YCT03003与YCT03004聚为一支，YCT03001-02、YCT03007与 YCT03017聚为一支，YCT03009单独为一支。

表4 天山堇菜基原植物、近缘种及药材样本的ITS2序列特征

图1 基于ITS2序列的单倍型NJ鉴别树，在图中显示分支支持率（≥50%，bootstrap 1000次重复）

18份不同来源的民族药材天山堇菜鉴定结果（图2），市售药材有8份为天山堇菜（占44.4%）；3份为香堇菜（占16.7%）；6份未在数据库中鉴定出有效结果，由两种植物组成（占33.3%），与堇菜属植物相似度较高，为堇菜属植物；另有1份为非堇菜属植物（占5.6%）。

3 讨论

3.1 天山堇菜DNA条形码鉴定数据库的可靠性

本研究首次采用DNA条形码技术建立民族药材“天山堇菜”的鉴定体系。研究中使用的18种126份天山堇菜及其近缘种植物凭证标本由新疆不同分类专家鉴定，保证了鉴定数据的准确性。通过建立126份堇菜属凭证标本样品的ITS2序列数据库，分析了种内种间变异，结果表明堇菜属不同种植物种间变异远大于种内变异；NJ树鉴别鉴定结果表明，不同植物均各自聚为一支，ITS2序列可将天山堇菜与其近缘种植物区分，因此ITS2序列在天山堇菜药材鉴定中具有很大的潜力。

3.2 市售药材天山堇菜的植物基原混乱

图2 市售民族药材天山堇菜植物来源

本研究建立的ITS2体系成功应用于不同植物来源的天山堇菜药材鉴定。通过将18份不同批次的市售“天山堇菜”药材ITS2序列与鉴定数据库比对，结果表明，目前天山堇菜的临床用药与现有标准存在很大差距，市售药材至少来源于5种植物，包括天山堇菜、香堇菜、堇菜属2种未知植物及薄荷属植物。药材在流通过程中以同属植物作为替代品的现象很常见[18,19]，目前《中华人民共和国药品标准(维药分册)》及《新疆民族自治区中药民族药饮片炮制规范》等地方标准中收载的天山堇菜药材唯一基原为天山堇菜V.kunawarensis，根据药材管理办法，未被收载的同属植物均为伪品。本研究中正品药材天山堇菜仅占44.4%，天山堇菜用药安全存在很大的隐患，其同属数种植物作为伪品流入市场，它们是否与天山堇菜具有相同的功效，还需要结合化学成分和药理作用进行深入研究。

3.3 DNA条形码在药材监管领域的应用前景

天山堇菜为新疆地产药材，其在民族药制剂中的使用量较大，由于资源有限，近年来主要依赖于进口，导致混伪品药材流入市场。DNA条形码技术近年来已经广泛应用于食品安全和中药材真伪鉴定等领域，本研究结果可在进出口海关检查过程及药品安全监测中可发挥重要作用，可从源头上杜绝伪品药材进入市场，为监管机构提供一种优良的检测手段，在民族药材基原控制领域具有广阔的应用前景。