填精通络方及其拆方对糖尿病性勃起功能障碍大鼠的性激素及阴茎海绵体eNOS酶表达的影响＊

商建伟，盛 文，李宪锐，穆 俊，于旭东，柳红芳

（1.北京中医药大学东直门医院 北京 100700；2.湖南中医药大学基础医学院 长沙 410208；3.首都医科大学附属北京妇产医院 北京 100123）

1 研究背景

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED）是最常见的一种男性性功能疾病，指阴茎持续不能达到和（或）维持足够的勃起以完成满意满意性生活，是目前众多男性非常关心的问题[1],而糖尿病（diabetes mellitus，DM）人群中并发ED的概率是普通人的2-3倍[2,3]，且临床症状更为严重[4]，在60周岁以上的中老年DM患者中，ED的发病率甚至可达到95%以上[5]。研究表明，DM是引起勃起功能障碍的最重要器质性疾病之一，DM并发ED的概率是非DM患者的3倍（分别为49.3%和15.6%）[6]。DM病程延长和其他血管神经并发症的出现而升高[7]、ED发病率随年龄增长而不断增加。

DM属于中医“消渴病”的范畴；勃起功能障碍属中医“阳痿”、“阴痿”范畴。DM并发ED即中医学的消渴合并阳痿。在消渴病的发展进程中，消渴日久，则必然发展为下消，导致肾精亏虚；肾虚日久，则元气亏虚、精血耗伤，无力推行气血，血瘀脉络是导致消渴并发阳痿的重要基础。因此，肾精亏虚、血瘀脉络是糖尿病性勃起功能障碍的根本病机[8]。本实验采用DMED大鼠模型，观察填精通络方及其拆方对生殖激素和阴茎海绵体结构的影响，探讨其治疗糖尿病性勃起功能障碍可能的作用机制。

2 材料与方法

2.1 实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠60只（8周龄，体质量230±50 g）购自北京维通利华验动物科技有限公司（合格证号NO.SYXK（京）2012-0001，北京，中国）。大鼠在标准的实验室条件下饲养，提供标准食物和水。北京中医药大学东直门医院动物与人类伦理委员会批准了这项研究。

2.2 试剂及仪器

链脲佐菌素（STZ）、阿扑吗啡(APO)、柠檬酸钠和柠檬酸购自美国sigma公司；血糖仪及试纸购自美国强生公司；大鼠睾酮（T）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）ELISA检测试剂盒购自中生北控股份有限公司；eNOS、p-eNOS兔抗大鼠一抗(Cell signaling公司，美国)；脱水机（Leica TP1020）—上海徕卡仪器有限公司、包埋机（KD-BM）—浙江省金华市科迪仪器设备有限公司、冻台（JB-L5）—武汉俊杰电子有限公司、切片机（RM2016）—上海徕卡仪器有限公司、摊片机（KDP）—浙江省金华市科迪仪器设备有限公司、烘箱（DHG-9077A）—上海精宏实验设备有限公司、光学显微镜（XSP-C204）—重庆光电仪器有限公司。

2.3 中药的制备

所有中药颗粒都来自北京中医药大学东直门医院（中国北京）。填精通络方颗粒由以下成分组成：淫羊藿15 g，熟地黄10 g，水蛭10 g，川牛膝10 g；填精方由淫羊藿15 g，熟地黄10 g组成；通络方由水蛭10 g，川牛膝10 g组成。将颗粒溶于蒸馏水中，并在2-8℃储存直至进一步使用。

2.4 DMED大鼠分组与模型

将成模大鼠随机分为正常组、模型组、对照组、填精通络组、填精组及通络组，每组10只。模型组、对照组、填精组、通络组及填精通络组大鼠建立DMED大鼠模型。将1 g STZ溶解在100 mL柠檬酸钠-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 4.5）中以达到最终浓度为10 mg·mL-1，在冰上操作并避光保存。禁食12小时后，以50 mg·kg-1剂量腹腔注射STZ溶液在右下腹。在STZ注射后72小时，1周和2周各从大鼠的尾静脉抽血测试血糖。每次的随机血糖＞16.7 mmol·L-1，尿量增加和饮食增加是成功DM大鼠模型的标志。

根据Heaton的方法[9]，将DM大鼠称重并放置在透明的玻璃箱中，光线暗到仅供观察，房间保持安静。在适应环境15分钟后，每只大鼠在颈部皮肤松弛处注射APO100 μg·kg-1并观察30分钟。阴茎增大，包皮回缩，龟头阴茎充血，阴茎末端出现称为阴茎勃起。如果勃起次数≥1，则认为勃起试验阳性。血糖＞16.7 mmol·L-1且勃起试验阴性的大鼠为DMED造模成功。

2.5 实验方法

造模成功后，正常组及模型组每日灌胃等体积的蒸馏水，对照组予以0.2 mg·kg-1他达拉非灌胃，每周两次；填精通络组予以填精通络方以9.3(g·kg-1)·d-1灌胃，填精组予以拆方Ⅰ号以7.2(g·kg-1)·d-1灌胃，通络组予以拆方Ⅱ号以2.1(g·kg-1)·d-1灌胃，正常组与模型组分别灌服等体积蒸馏水，连续30天。

2.6 指标检测及方法

①大鼠血糖检测：采用大鼠尾部取血的方式取血，使用便携式血糖仪检测各组大鼠治疗前后的血糖水平；②大鼠性激素检测：大鼠以10%的水合氯醛按3 mL·kg-1体重比腹腔注射进行麻醉，麻醉后采腹主动脉血，离心后取上层血清，用酶联免疫分析法测定各组大鼠的大鼠睾酮（T）、黄体生成素（LH）、促卵泡素（FSH）等性激素水平的差异；③取1 cm阴茎组织石蜡包埋切片，进行eNOS的免疫荧光染色。400倍光镜下采集图像，利用图像分析软件（Image-ProPlus 6.0）来分析荧光吸光度。

2.7 统计分析

所有来自本研究的计量数据均使用SPSS 20.0统计软件进行分析。结果表示为平均值±标准偏差。在满足正态分布条件下，各组间采用独立样本t检验；不满足正态分布情况下，若满足方差齐性，则使用单因素方差分析（ANOVA）分析组间差异，若不满足方差齐性，则采用非参数检验法，P＜0.05表示差异显著。

3 结果

3.1 大鼠一般情况

随着病程的进展，模型组、对照组、填精组、通路组以及填精通络组均出现多饮、多食、多尿、毛失、去光泽、脱毛、活动减少等DM症状。而正常组的大鼠毛色光亮顺滑，体重增加，好动。

3.2 治疗前后大鼠血糖水平差异

实验结果表明，填精通络方能明显降低大鼠血糖水平。填精组、通络组、填精通络组治疗后血糖均显著低于治疗前血糖（P＜0.01）。与模型组比较，填精组、通络组及填精通络组的血糖明显降低（P＜0.01）；与对照组比较，填精通络组的血糖明显降低（P＜0.01）；与通络组比较，填精组和填精通络组的血糖明显降低（P ＜ 0.05）（表1）。

3.3 大鼠性激素水平差异

实验结果表明，填精通络方能明显升高大鼠血清T水平。填精组、通络组及填精通络组的血清T要明显高于模型组（P＜0.05）；填精通络组的血清T含量明显高于对照组（P＜0.05）；填精通络组的血清T含量明显高于填精组和通络组（P＜0.01）。LH与FSH在各组外周血液中浓度均无明显变化（P＞0.05）（表2）。

3.4 大鼠阴茎海绵体eNOS酶表达情况

大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达主要在阴茎海绵体血管内皮细胞及窦状隙内皮细胞的细胞核和细胞浆内。利用图象分析系统来测定每组的eNOS酶的含量多少。实验结果表明：填精通络方能明显改善大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况。填精组、通络组及填精通络组的大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况明显高于模型组（P＜0.01）；填精通络组的大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况明显高于对照组（P＜0.05）；通络组的大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况明显高于填精组（P＜0.05）；填精通络组的大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况明显高于填精组和通络组（P＜0.01）（表3）。

3.5 阴茎海绵体病理组织学结果

正常组阴茎海绵窦毛细血管丰富，未见明显的阴茎海绵体间隔，可见大量不规则血窦间隙，血窦、内皮细胞、平滑肌细胞、间质组织及微血管腔结构清晰，血窦间隙表面附有扁平的内皮细胞，血窦小梁含有大量平滑肌细胞及胶原纤维。模型组阴茎海绵体间隔明显，阴茎海绵体血窦、内皮细胞、平滑肌细胞分布杂乱，阴茎海绵体平滑肌细胞数量减少，血管内皮细胞连续性破坏，胶原纤维密度增加，间质组织大量增生、排列紊乱，血管壁增厚，呈纤维样变，管腔变小或闭塞。其余各组病理变化介于两者之间（图1）。

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较（mmol·L-1，x±s）

表2 大鼠性激素水平差异

表3 大鼠阴茎海绵体eNOS酶表达情况

4 讨论

图1 阴茎海绵体组织病理学检测

肾精亏虚、脉络瘀阻是DMED最基本病机，治疗当以补肾活血，填精通络为首要。辨证施治时需在补肾活血，填精通络的前提下，再根据不同的证型具体的临证加减药物及其用量。“气为血之帅，血为气之母。”气虚则难以推动血行，导致气虚血瘀，脉络瘀阻。使得宗筋不得气血之濡养，则发为阳痿。所谓“肾虚必致血瘀，瘀血必归于肾”[10]，是因为血瘀脉络而导致肾精化生不畅。所以，DMED在治疗上应以补肾活血，填精通络为主要的治疗方法，肾精得补，淤血得散才能使得肾中精气化生有源，宗筋得以气血濡养，方能起痿。

临床上我们发现填精通络方在治疗DMED上有着良好的效果，不仅能过改善患者勃起功能，还能明显辅助降低患者血糖。研究表明[11]DMED的严重情况和血糖控制情况是密切的，DMED的治疗是以控制血糖为基础的，防止糖尿病对血管、神经的进一步损害。本实验结果表明，填精组、通络组、填精通络组治疗后血糖均显著低于治疗前血糖，尤其是填精通络组最为明显，但不管何组，血糖降低的幅度并不大，可见在治疗DM的时候，还是其他辅助方式来治疗DM。

T是一种类固醇类雄激素，主要由睾丸间质细胞分泌。T能通过提高男性性欲[12]、激活一化氮合酶[13]、降低阴茎海绵体血管收缩[14]等方面来刺激阴茎的勃起及维持。临床上我们也发现DM患者血清T水平偏低，补充一定量的T也有助于改善患者的勃起功能。本实验结果表明，填精组、通络组及填精通络组的血清T要明显高于模型组，尤其是填精通络组，虽然仍不及正常组，但是改善效果依然明显，但各组中LH与FSH在各组外周血液中浓度均无明显变化，我们分析可能的原因是填精通络方能通过改善T产生的环境从而升高血清T水平，但填精通络方对于垂体分泌的FSH与LH却没有明显的影响。

阴茎勃起是在机体神经内分泌的调控下阴茎海绵体血管活动的过程，海绵体内神经末梢及海绵窦内皮细胞在eNOS酶的作用下合成并释放一氧化氮(nitric oxide,eNOS),进而导致阴茎海绵体血管平滑肌舒张，大量血流进入海绵体组织，从而导致海绵体内压升高完成勃起过程[15]。本实验结果表明：填精通络方能明显改善大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况；填精组、通络组及填精通络组的大鼠阴茎海绵体eNOS酶的表达情况明显高于模型组，尤其是以填精通络组最为明显，而对照组阴茎海绵体eNOS酶的表达情况要高于填精组和通络组，说明他达拉非能明显改善阴茎海绵体eNOS酶的表达情况，这也是他达拉非治疗ED的具体机制之一；而填精通络组的改善优于对照组，但是仍低于正常组,说明填精通络组在治疗DMED方面,治疗方案还有待进一步的改善。