麦冬多糖对转化生长因子-β1诱导心肌细胞凋亡的影响

陈碧珊 吴红卫 李艳 张滨 沈勇刚

(广东药科大学附属第一医院 1药学部临床药学科,广东 广州 510000；2康复科)

转化生长因子(TGF)-β1是TGF-β超家族中活性最强的亚型，参与细胞增殖凋亡、免疫调节、胚胎发生、创伤修复等的调控〔1，2〕。研究表明，TGF-β1参与心肌病、心肌梗死后心力衰竭、高血压心肌肥厚等多种心血管疾病的发生发展，且可引起心肌细胞凋亡〔3，4〕。目前也有大量研究使用TGF-β1建立心肌细胞凋亡模型〔5，6〕。麦冬为常用的滋阴中药，主要化学成分为多糖类和皂苷，麦冬多糖(MDG-1)是从麦冬中分离纯化后得到的均一分子量的β-D-果聚糖〔7〕。研究表明，MDG-1对心肌缺血损伤具有改善作用〔8〕，但MDG-1对TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡的影响及作用机制尚未明确。本研究以大鼠心肌细胞H9c2为研究对象，使用TGF-β1建立心肌细胞损伤模型，旨在观察MDG-1对TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡的影响，并进一步探究其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料及主要试剂和仪器 大鼠H9c2心肌细胞购自中科院上海细胞研究所细胞库。噻唑蓝(MTT)试剂购自美国Sigma；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；增殖细胞抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、p53、核因子(NF)-κB p65、KB抑制蛋白激酶(IKK)α和β-catenin抗体均购自美国CST；Multiskan酶标仪购自美国Thermo；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD。

1.2细胞培养 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养液培养H9c2心肌细胞，培养条件：37℃、CO2体积分数5%、适度饱和。实验选择生长良好的对数期细胞。

1.3分组及处理 H9c2心肌细胞分为对照组、TGF-β1组和MDG-1组。对照组及TGF-β1组均加入DMEM培养液，MDG-1组加入100 mg/L MDG-1，每组设置6个复孔，于37℃恒温、饱和湿度及5% CO2培养箱中培养12 h，弃掉上清，对照组加DMEM培养液，TGF-β1组和MDG-1组加入20 ng/ml TGF-β1，继续培养12 h，收集细胞，用于实验研究。

1.4MTT检测细胞活力 以1×105个/ml的密度接种H9c2心肌细胞于96孔板，每孔加入细胞悬液200 μl，于37℃、饱和湿度及5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞贴壁后，弃去上清，按照1.3方法处理细胞，收集处理后继续培养12 h的3组细胞，加入MTT溶液，每孔20 μl，于37℃恒温、饱和湿度及5% CO2培养箱中培养4 h，弃掉上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，酶标仪于490 nm处测定各孔的吸光度值(A值)。实验重复3次。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡率 采用Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡率。以3×105个/ml的密度接种生长至对数期的H9c2心肌细胞于96孔板，分组及处理方法同1.3，收集处理至规定时间的3组细胞，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，胰酶消化后收集细胞。用400 μl 1倍结合缓冲液重悬细胞，细胞悬浮液中加入Annexin V-FITC染色液5 μl，混匀后避光4℃冰箱孵育15 min，再加入PI染色液10 μl，混匀后避光4℃冰箱孵育5 min，上机前再加入300 μl 1倍结合缓冲液，1 h内进行流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6流式细胞术检测活性氧(ROS)水平 收集按照1.3分组处理12 h的3组细胞，用终浓度为10 μmol/L DCFH-DA的无血清培养液悬浮细胞，于37℃条件下孵育细胞20 min，通过流式细胞仪检测。由于ROS探针DCFH-DA本身是无荧光，但能穿过细胞膜，且ROS可以将细胞内不含有荧光的DCFH氧化为产生荧光的DCF，因此通过检测DCF的荧光强度可间接反映细胞内ROS水平。实验重复3次。

1.7Western印迹 收集按照1.3分组处理12 h的3组细胞，适量细胞裂解液提取细胞总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法进行蛋白定量，每孔道上样等量总蛋白，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶进行蛋白分离，然后将蛋白通过电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗膜，加一抗(1∶1 000稀释的PCNA、Bcl-2、p53、NF-κB p65、IKKα和β-catenin抗体)，4℃孵育过夜，洗膜，加二抗，室温孵育1.5 h，用电化学发光(ECL)进行显色。以GAPDH为内参，用gel pro4.0软件分析各目的蛋白与GAPDH蛋白的灰度值比值，其比值即为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学方法 应用SPSS21.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组细胞活动比较 TGF-β1组细胞活力(A值：0.302±0.025)显著低于对照组(0.687±0.054，P<0.05)，MDG-1组(0.529±0.047)显著高于TGF-β1组(P<0.05)。3组比较差异有统计学意义(F=58.622，P=0.000)。

2.2各组细胞凋亡率比较 TGF-β1组细胞凋亡率(30.26%±3.05%)显著高于对照组(3.12%±0.03%，P<0.05)，MDG-1组(10.54%±0.98%)显著低于TGF-β1组(P<0.05)。3组比较差异有统计学意义(F=172.525，P=0.000)，见图1。

2.3各组ROS水平比较 TGF-β1组ROS水平(荧光强度：86.42±3.26)显著高于对照组(32.18±1.57，P<0.05)，MDG-1组(53.55±2.41)显著低于TGF-β1组(P<0.05)。3组比较差异有统计学意义(F=355.472，P=0.000)。

2.4MDG-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞增殖凋亡相关蛋白表达的影响 TGF-β1组PCNA和Bcl-2蛋白表达显著低于对照组，p53蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)；MDG-1组PCNA和Bcl-2蛋白表达显著高于TGF-β1组，p53蛋白表达显著低于TGF-β1组(P<0.05)，见图2，表1。

2.5MDG-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞Wnt/β-catenin信号及NF-κB信号的影响 TGF-β1组β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)，MDG-1组显著低于TGF-β1组(P<0.05)，见图3，表2。

图1 MDG-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响

图2 MDG-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞PCNA、Bcl-2和p53蛋白表达的影响

表1 各组PCNA、Bcl-2和p53蛋白表达

与对照组比较：1)P<0.05；与TGF-β1组比较：2)P<0.05;下表同

图3 MDG-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表达的影响

表2 各组β-catenin、NF-κB p65和IKKα蛋白表达

3 讨 论

心脑血管疾病具有致残率高、复发率高和死亡率高的特点，且有较多的并发症，严重威胁人类的生命健康〔9〕。研究发现，心肌细胞除进行自身的分裂、再生外，还参与病变组织修复及心脏自稳态的维护〔10〕。在多种心血管疾病中，心肌细胞的凋亡贯穿于整个过程，因此，有效降低心肌细胞凋亡对于心血管疾病治疗具有重要意义。我国中药资源丰富，植物多糖在抗肿瘤、抗衰老、免疫活性调节、心血管疾病等方面均发挥重要作用。目前对MDG-1在心血管疾病方面的研究较少，有研究发现，MDG-1可改善心肌缺血造成的损伤〔8〕，20～200 mg/L MDG-1对心肌细胞无明显的细胞毒性〔11〕。因此，本研究选择100 mg/L的MDG-1。心肌细胞凋亡可能是非缺血和(或)缺血性心肌病患者心肌细胞死亡的一种形式，心肌细胞一旦发生凋亡，原有的心肌将被胶原纤维取代，继而引起心室重构、心肌肥厚、心肌纤维化等，最终导致心力衰竭。研究表明，在心力衰竭过程中TGF-β1表达急剧增加，且在TGF-β1刺激下可引起心肌细胞凋亡〔12〕。因此，在多种心血管疾病研究中使用TGF-β1建立心肌细胞损伤模型。本研究结果显示，MDG-1可逆转TGF-β1对心肌细胞活力的抑制作用，抑制由TGF-β1引起的心肌细胞凋亡。可见，MDG-1对心肌凋亡具有抑制作用。

氧化应激是生物体一个正常的生命活动，ROS是重要的氧化应激水平反应指标。有研究表明，ROS的过度产生可激活下游的一些促进细胞重构转录因子及信号激酶，也可引起心肌纤维细胞的增生，使在细胞外的基质金属蛋白酶激活，最终导致心肌基质重构〔13，14〕。也有研究指出，抑制ROS水平可降低心肌细胞凋亡〔15〕。本研究结果发现，MDG-1可降低由TGF-β1引起的心肌细胞ROS水平的升高，提示MDG-1降低心肌细胞凋亡机制可能与降低氧化应激有关。Wnt/β-catenin信号是Wnt信号中的经典信号通路，参与调控细胞增殖、凋亡、生长发育及分化等〔16〕。研究表明，Wnt/β-catenin信号在健康成人心脏中是沉默的，而在多种心血管疾病中该信号被持续激活，从而可引起细胞凋亡〔17〕。NF-κB是一个重要的核转录因子，可调节细胞凋亡。有研究表明，在多种心血管病中该信号通路被活化，可引起细胞凋亡〔18〕；也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信号和NF-κB信号可通过对下游的增殖凋亡相关的PCNA、p53、Bcl-2、Bax的调节影响心肌细胞增殖和凋亡〔19～21〕。本研究结果提示，MDG-1对心肌细胞活力及凋亡的影响与抑制Wnt/β-catenin信号和NF-κB信号有关。

综上，MDG-1可增强心肌细胞活力，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能与降低细胞内ROS水平及抑制Wnt/β-catenin和NF-κB信号有关。本研究仅为细胞水平的检测，且未进行体内实验，因此还需进一步的证实。