银杏叶提取物(EGb761)对大鼠急性创伤性脑水肿的影响

亢璐 杨智航

(沈阳医学院生理学教研室，辽宁 沈阳 110034)

近年来由交通事故及其他意外造成的创伤性脑损伤(TBI)日渐增多，其致死率和致残率居高不下，已成为一个严重的全球性公共卫生问题〔1〕。TBI引起血脑屏障结构损伤和功能失调后，血液中的成分进入脑组织，形成脑水肿，使颅内压升高，严重的可形成脑疝，危及生命。目前临床治疗创伤性脑水肿的药物，如20%甘露醇，虽可重复使用，但有反弹现象，且长期大量使用可造成低钠血症和血尿；速尿的利尿作用迅速、强大，但易导致水和电解质紊乱；复方甘油适用于心、肾功能不全的脑水肿患者，但其作用却远不如甘露醇直接、有效，这些常用药物的不足之处需要寻找更好的药物替代。研究表明在脑损伤时，氧自由基在脑组织中大量增加，自由基使细胞膜系统受损，血脑屏障损害，从而引起脑水肿〔2〕，而银杏叶提取物(EGb761)是一种高效氧自由基清除剂，具有抗氧化作用，耐受良好，对人体安全〔3〕。本研究通过给予创伤后大鼠不同剂量EGb761，旨在探讨其对大鼠急性创伤性脑水肿的影响及潜在机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 健康成年SD大鼠60只，雌雄不限，体重200～250 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号:SCXK(辽)2015-0001。采用随机单位设计法将SD大鼠分为:假手术(A)组、创伤+等剂量生理盐水(B)组、创伤+低剂量(25 mg/kg)EGb761(C)组、创伤+高剂量(50 mg/kg)EGb761(D)组。每组大鼠15只，其中6只做干湿重法，3只做苏木素-伊红(HE)染色及二氢乙锭(DHE)染色，6只做Western印迹检测。

1.2主要试剂 EGb761注射液(台湾济生化学制药厂股份有限公司)；水通道蛋白(AQP)4多克隆抗体(武汉云克隆科技股份有限公司)；β-actin单克隆抗体(美国Proteintech公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)配制试剂盒(上海碧云天公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝公司)；DHE(美国Sigma公司)。

1.3实验方法

1.3.1颅脑创伤动物模型的建立 根据Feeney自由落体致伤法建立急性颅脑创伤模型。动物称重后，经10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，头部固定于脑立体定位仪上，备皮，消毒后沿正中线切开头皮并剥离骨膜，暴露右顶骨，以冠状缝后3 mm，中线右旁3 mm处为圆心，开一直径5 mm骨窗，保证硬脑膜完整，将直径5 mm金属垫片置于骨窗，撞击杆垂直置于上方，40 g重锤，25 cm高处，自由落体，撞击金属垫片，致使大鼠颅脑损伤。打击完成后，用骨蜡封闭骨窗，涂抹青霉素，缝合头皮。A组切开头皮，只造骨窗，不做打击。

1.3.2EGb761给药方法 EGb761注射液，每支(5 ml)含有EGb761 17.5 mg，其中银杏黄酮苷4.2 mg。该药物人的临床剂量为1～2 mg/kg，即大鼠的等效剂量为6.3～12.6 mg/kg，大鼠的用量一般取人用量的6～8倍为有效量。造模后，C组和D组，在创伤1 h后，通过腹腔注射分别给予EGb761注射液25 mg/kg和50 mg/kg；A组和B组大鼠在相应时间点，腹腔给予相同剂量生理盐水。

1.3.3干湿重法测大鼠脑组织含水量 大鼠脑创伤后24 h，在麻醉下断头取脑，分离损伤侧及未损伤侧脑组织，将其精确称重即为湿重(Ww)，在100℃烤箱内烤24 h至恒重，称干重(Dw)，按Elliott公式计算脑组织含水量，即脑组织含水量(%)=(Ww-Dw)/Ww×100%。

1.3.4脑组织切片的制备及HE染色 4%多聚甲醛灌流后，提取大鼠损伤侧脑组织浸入4℃的4%多聚甲醛中固定72 h。取损伤区域直径约为5 mm脑组织制成石蜡切片。切片经脱蜡水化后，进行HE染色，然后脱水透明、封片，在显微镜下观察。

1.3.5DHE染色实验 石蜡切片经烤片及脱蜡后，DHE荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成10 μmol/L的溶液，每个组织加入50～100 μl稀释液，4℃过夜，去除DHE荧光探针稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，各5 min，滴加抗荧光淬灭封片剂封片，通过共聚焦显微镜观察DHE荧光变化。

1.3.6Western印迹检测AQP4表达水平 麻醉后断头，取损伤灶周围约100 mg脑组织研磨匀浆，提取蛋白，并测定蛋白含量。各样本等量总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转膜后进行封闭；加入AQP4特异性抗体(1∶200)，4℃过夜；二抗稀释液(1∶2 000)室温下孵育2 h，最后使用Omega Lum C 进行电化学发光(ECL)显影，Image J软件对实验结果进行分析。以AQP4条带累积光密度值与β-actin条带累积光密度值之比表示AQP4的表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1干湿重法测定脑含水量 创伤所引起的损伤侧脑水肿程度在24 h后明显增加，与A组〔(78.48±0.32)%〕相比，B组〔(82.43±0.34)%〕脑含水量明显升高(P<0.05)；C组〔(79.11±0.15)%〕和D组〔(79.37±0.12)%〕，脑含水量虽然高于A组，但差异没有统计学意义(P>0.05)。相对于B组，C组与D脑含水量有显著降低(P<0.05)；C组与D组间脑含水量差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2脑组织HE染色 如图1所示损伤侧脑皮质HE染色结果，A组大脑皮质结构完整，细胞形态正常，着色均匀分布。B组大脑皮质水肿区组织间隙肿胀明显，着色浅，细胞和血管周围腔隙增宽。C组和D组细胞和血管周围腔隙减小，组织间隙肿胀改善，水肿区缩小。

2.3氧自由基在大脑皮质的表达 B组(3.83±0.10)、C组(1.32±0.15)和D组(1.40±0.23)大脑皮质中DHE染色的平均氧化荧光密度值高于A组(1.25±0.17)，其中B组与A组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；C组和D组平均氧化荧光密度值较B组显著降低(P<0.05)，而C组和D组之间无明显差异(P>0.05)。见图2。

2.4AQP4在大脑皮质的表达 B组(1.01±0.27)、C组(0.48±0.15)和D组(0.52±0.18)AQP4表达水平高于A组(0.46±0.13)，其中B组与A组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；与B组相比，C组和D组大鼠脑组织中AQP4的表达水平明显降低(P<0.05)；而C组和D组大鼠脑组织AQP4表达水平无明显差异(P>0.05)。见图3。

图1 各组大鼠脑皮质HE染色结果(×200)

图2 各组大鼠脑皮质DHE染色结果(×400)

图3 Western印迹检测各组大鼠脑皮质中AQP4蛋白表达

3 讨 论

急性脑创伤后，氧自由基增多、乳酸性酸中毒、兴奋毒性氨基酸、钙离子超载等因素使脑细胞能量代谢失衡，离子浓度和渗透压升高，引起创伤性脑水肿〔4〕；在1 h内开始，持续2～24 h，以星形胶质细胞受累为主〔5〕，这与本研究结果相同，损伤灶周围组织间隙肿胀明显。本研究结果提示EGb761能有效减缓脑水肿的发生，25 mg/kg和50 mg/kg的EGb761疗效无差异，25 mg/kg是更适剂量。

神经细胞和脑微血管内皮细胞既是氧自由基的产生部位，又是其受累最为严重的部位〔6〕。氧自由基增多使神经细胞膜上钠泵、钙泵、细胞色素氧化酶等重要的脂质依赖酶失活，膜流动性和通透性增加；Ca2+大量内流及兴奋毒性氨基酸释放，引起神经细胞和磷脂代谢紊乱，导致严重的细胞毒性水肿〔7,8〕。EGb761是德国Schwabe公司生产的银杏标准提取物，其主要活性成分是黄酮类和萜类内酯类。该药物耐受良好，可见胃肠道不适、头痛、血压降低、过敏反应等现象，一般不需特殊处理即可自行缓解。长期静脉注射时，应改变注射部位以减少静脉炎的发生。根据药物说明该药物严禁混合使用，谨慎联合用药。银杏叶黄酮可通过调节氧自由基反应酶的活性，减少氧自由基产生，抑制细胞膜的脂质过氧化反应，保护脑细胞膜〔9,10〕。应用EGb761预处理，可以显著降低脑缺血诱导的细胞水肿形成和神经退化〔11〕。银杏叶提取物可通过直接清除自由基或间接抑制自由基的形成而发挥抗炎作用，减轻海马神经元损伤〔12〕。本研究结果提示脑含水量降低与EGb761清除脑损伤灶氧自由基有关。AQP4主要表达在胶质细胞足突、胶质界膜及室管膜中，其兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能〔13〕。创伤后大鼠脑组织表现为细胞毒性水肿时，AQP4表达上调，而AQP4的上调又将进一步促使脑水肿加重，提示AQP4是导致细胞毒性脑水肿关键因素〔14〕。本研究结果显示EGb761干预后，脑损伤灶AQP4表达水平降低，提示AQP4可能是EGb761缓解创伤后脑水肿的作用靶点。

综上所述，EGb761可通过清除氧自由基，降低AQP4表达，改善脑细胞内外稳态失衡，这为缓解创伤引起的脑水肿，减少毒副作用，提供新的思路。