β-catenin、COX-2、15-PGDH在结直肠癌组织中的表达及意义

蒋海涛 徐颖 王兴兰 杜胜奇 钟江利 王红

(遵义医学院附属医院 1消化内科，贵州 遵义 563003；2肿瘤科；3呼吸与危重症医学科呼吸二病区)

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其早期诊断困难、死亡率高，最新报道指出，在全球范围内结直肠癌的发病率占恶性肿瘤第4位(6.1%)，死亡率高居第3位(9.2%)〔1〕。结直肠癌的发生发展是多步骤多阶段的复杂过程，目前研究已发现多种信号通路可能参与了结直肠癌的发生发展过程，如Wnt/β-连环蛋白(catenin)、Notch、JAK/STAT3等信号通路〔2,3〕。合成前列腺素的关键限速酶环氧合酶(COX)-2在多种肿瘤尤其是消化道肿瘤组织中表达上调；而前列腺素降解酶15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)在多种肿瘤组织中表达下调；在结直肠癌的研究中亦有类似的结论。Wnt/β-catenin、COX-2、15-PGDH在结直肠癌演变过程中均发挥了重要作用，但其具体机制及相互作用尚不明确。本实验旨在探讨β-catenin、COX-2、15-PGDH在结直肠癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集遵义医学院附属医院手术切除的结直肠癌标本30例(肠癌组)，内镜下手术切除的结直肠腺瘤标本30例(腺瘤组)，正常结直肠黏膜组织10例(正常组)。所有标本病理及临床资料完整，所有手术患者术前均无放、化疗，无非甾体抗炎药治疗。在30例结直肠癌标本中，右半结肠癌9例，乙状结肠癌7例，直肠癌14例，其中男17例，女13例，年龄33～80岁，平均58.5岁，<60岁11例，≥60岁19例。

1.2主要试剂 逆转录试剂盒、扩增试剂盒、引物合成、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒为宝生物工程公司提供，鼠抗-β肌动蛋白(actin)、脱脂奶粉为博士德生物有限公司提供，抗前列腺素脱氢酶、抗-β-catenin抗体为Abcam公司提供，兔抗-Cox-2/COX-2为北京博奥森生物技术有限公司提供，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)为碧云天生物技术研究所提供，焦碳酸二乙酯原液、多聚耐氨酸、通用二抗试剂盒为北京博奥森生物技术公司提供，超低蛋白分子量Marker为Sigma公司提供。

1.3实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达 使用Trizol试剂提取组织总RNA，按逆转录试剂盒(宝生物工程有限公司)说明合成cDNA。目的基因β-catenin引物，上游：5′-GCTGATCTTGGA CTTGATATTGGTG-3′，下游：5′-GTCCATACCCAAGGCATCCTG-3′；COX-2上游：5′-CCAGCACTTCACGCATTCCA-3′，下游：5′-GCTGTCTAGCCAGAGTTT CACC-3′；15-PGDH上游：5′-TGACTCATCCTGTCTGCTAACTCCA-3′，下游：5′-AGGGCAAGATATGACA ACATTCCA-3′。内参照β-actin上游：5′-CCAG GGCGTTATGGTAGGCA-3′,下游：5′-TTCCATATCCCAGTTGGT-3′。分别测定COX-2、15-PGDH与内参β-actin的PCR扩增产物的吸光度值，其比值作为待测样本mRNA表达水平。

1.4Western印迹法检测相关蛋白表达 将提取的结直肠组织蛋白与预染蛋白Marker一起上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后电转移至聚偏氟乙烯(PDVF)膜，置于配置好的5%脱脂奶粉/封闭1 h，加入一抗〔目的蛋白：兔抗人多克隆抗体β-catenin(1∶4 000)、COX-2(1∶500)、15-PGDH(2 μg/ml)，内参β-actin小鼠抗人单克隆抗体(1∶400)〕；4℃过夜后加入二抗(山羊抗兔、山羊抗小鼠抗体，均以1∶1 000配制)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，化学发光试剂(ECL)显色剂完成显色及曝光。

1.5免疫组化法检测相关蛋白表达 所有组织标本石蜡固定后连续切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、柠檬酸盐抗原修复等步骤后，使用免疫组织化学SP法进行染色，二氨基联苯胺(DBA)显色剂显色，所用抗体浓度分别为兔抗人多克隆抗体β-catenin(1∶400)、COX-2(1∶500)、15-PGDH(1∶500)。采用半定量积分法进行结果判定。β-catenin在正常结直肠组织中定位于细胞膜，阳性表达为细胞质、细胞核中出现棕黄色至棕褐色颗粒。COX-2、15-PGDH定位于细胞质或细胞核，阳性表达为胞质、胞核中出现浅黄色至棕黄色颗粒。首先在低倍镜下浏览整张切片，选择高表达区域在高倍镜下进一步观察，共观察5个高倍视野，每个视野记数200个细胞，共计数1 000个，根据染色深度和阳性细胞率分别评估，综合判定。①按染色深度评分：无染色0分，浅黄色颗粒1分，棕黄色2分，深棕色3分。②按阳性细胞的比率评分：阳性细胞数占总细胞数<10%计0分，≥10%且<25%计1分，≥25%且<50%计2分，≥50%计3分；③每张玻片总积分为2项评分相加：0～1分为阴性(-)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性()，5～6分为强阳性()，≥2分为阳性表达。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1RT-PCR及Western印迹法检测结果 β-catenin及COX-2 mRNA及蛋白在正常组、腺瘤组、肠癌组表达呈逐渐升高趋势(P<0.05)。15-PGDH mRNA及蛋白在正常组、腺瘤组、肠癌组表达呈逐渐降低趋势(P<0.05)。见图1、表1。

A、B:正常组;C～E：腺瘤组;F、G:肠癌组图1 各组β-catenin、COX-2、15-PGDH 蛋白表达

表1 各组β-catenin、COX-2、15-PGDH mRNA及蛋白表达

与正常组比较：1)P<0.05；与腺瘤组比较:2)P<0.05；下表同

2.2免疫组化结果 β-catenin和COX-2在正常组、腺瘤组、肠癌组的阳性标的率和表达强度均呈逐渐上升趋势(P<0.05)。15-PGDH在腺瘤组和肠癌组中表达明显低于正常组(P<0.05)，且腺瘤组显著低于肠癌组(P<0.05)。见图2～4、表2。

图2 β-catenin在3组中的表达(SP,×400)

图3 COX-2在3组中的表达(SP,×400)

图4 15-PGDH在3组中的表达(SP,×400)

表2 各组β-catenin、COX-、15-PGDH蛋白表达(n,n=20)

3 讨 论

Wnt/β-catenin信号通路调节细胞增殖和分化，精细地调控着细胞的生命活动，是胚胎生长发育必需的重要通路，而该通路的过度激活或异常表达可导致肿瘤发生〔4,5〕。在诸多信号通路中，Wnt/β-catenin信号通路是研究较早、较深入的信号通路之一；在结直肠癌中，有研究发现超过94%的结直肠癌患者存在Wnt信号通路的异常表达和激活〔6〕。Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路，β-catenin是该信号通路的关键蛋白。在正常结直肠组织中，β-catenin表达在细胞膜，在胞质和胞核中少见，当Wnt/β-catenin通路被异常激活后，β-catenin在胞质和胞核出现大量聚集，激活下游的靶基因，使肿瘤干细胞的自我更新和分化功能异常，从而导致肿瘤的发生。本实验表明，在正常结直肠组织、结直肠腺瘤、结直肠癌组织中β-catenin的表达呈逐渐增强趋势。免疫组化结果显示β-catenin在正常结直肠组织中主要表达在细胞膜，在胞质和胞核中鲜有表达，而随着正常组织、腺瘤、结直肠癌的演变，β-catenin在胞质和胞核中出现聚集且逐渐增强，在结直肠癌中表达阳性率最高，阳性强度最强。由此推测，在结直肠组织中β-catenin的高表达极有可能促进了结直肠肿瘤的发生，而β-catenin异位高表达可能是β-catenin在胞质中的降解异常所致。

Wnt/β-catenin在结直肠癌中的研究并非孤立，多种基因与之存在相互作用，研究发现近80%的结直肠癌中出现COX-2阳性表达〔7〕，COX-2被激活后产生的前列腺素(PG)E2使降解复合体解聚，导致β-catenin不能被正常磷酸化和降解，从而激活下游靶基因并促进结直肠肿瘤的发生。亦有研究认为，Wnt信号通路激活后，β-catenin与T细胞因子(TCF)-4结合，而TCF-4正好位于COX-2的转录启动子内，即COX-2是Wnt/β-catenin通路的靶基因之一。COX-2在癌症中研究已久，早在20余年前DuBois等〔8〕的报道就指出85%～90%的结直肠癌和40%～50%有恶变倾向的结直肠腺瘤中出现COX-2的高表达。有国外学者使用人工合成的COX-2选择性抑制剂进行肿瘤的预防、治疗并取得了显著的成果，其主要原因是抑制了PG的合成〔9〕。本研究推测在结直肠组织中COX-2的表达上调极有可能促进了结直肠癌的发生、发展，而β-catenin与COX-2在结直肠癌的发生、发展等过程中是否存在相互关系及其机制目前尚不明确。

COX-2是合成PG的关键限速酶，而15-PGDH是降解前列腺素的关键酶，对COX-2有生理性的拮抗作用。15-PGDH广泛存在于哺乳动物体内，在正常的胃、结直肠、肺、肾、乳腺等组织中均有高水平表达，可催化活性较强的15-羟基PG转化为活性较低的15-酮基PG，从而降解PG〔10〕。近年来，COX-2与15-PGDH在肿瘤中的关系备受关注。Lim等〔11〕研究发现，在结直肠癌中15-PGDH 的阳性率为46.1%，而COX-2的阳性率高达80.5%。Yang等〔12〕进一步研究认为，15-PGDH的早期失活，伴随着COX-2的激活，促进了PGE2的产生，并导致了结直肠癌的发生。本实验结果与国内外研究结果一致，由此推测，在结直肠组织中15-PGDH可能充当COX-2的拮抗剂，抑制COX-2活性的增加从而抑制结直肠癌的发生、发展，发挥抑癌基因的作用。

综上，β-catenin、COX-2在结直肠组织中的异位及异常高表达可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥了关键作用，而15-PGDH在结直肠组织中的表达降低或缺失可能也促进了结直肠癌的发生、发展。