敲低Tribbles同源蛋白3抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖

熊勇 彭定凤 胡勇钧 唐哨勇 冮洪生

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院心血管内科，湖北 武汉 430033)

心肌纤维化是心肌梗死后常见的病理过程，心肌成纤维细胞过度增殖是心肌纤维化发生的重要原因之一，血管紧张素(Ang)Ⅱ是心肌纤维化发生的诱导因子，在心肌纤维化过程中表达水平上调〔1〕。体外研究显示，AngⅡ可诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成〔2〕。Tribbles同源蛋白(TRIB)3是一个蛋白激酶，参与调控细胞增殖过程，TRIB3参与动脉粥样硬化、糖尿病心肌纤维化等病理过程〔3,4〕。目前研究显示，TRIB3在高糖诱导的心肌成纤维细胞中表达上调，敲低其表达可抑制高糖诱导的心肌成纤维细胞纤维化过程，而对于TRIB3在AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用尚不清楚〔5,6〕。本实验用AngⅡ处理心肌成纤维细胞，探讨TRIB3在AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用。

1 材料与方法

1.1材料 出生24 h的SD乳鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供；羟脯氨酸检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；AngⅡ购自美国Sigma公司；SYBR实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒、放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液购自上海贝博生物科技有限公司；细胞RNA提取试剂盒购自大连宝生物工程公司；GAPDH抗体、TRIB3抗体、Ⅰ型胶原(COLLⅠ)抗体、Ⅱ型胶原(COLLⅡ)抗体和基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体购自美国Abcam；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；一氧化氮(NO)含量检测试剂盒、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；TRIB3 siRNA慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体由吉满生物科技(上海)有限公司构建。

1.2心肌成纤维细胞分离培养 用差速贴壁法分离培养心肌成纤维细胞〔7〕，无菌条件下取出生24 h的乳鼠心脏，放在4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中，洗涤3次以后，用75%的酒精浸泡30 s，PBS洗涤，把心脏剪碎(组织块约1 mm3)，在组织中添加等体积的0.1%的COLLⅡ酶和0.125%的胰蛋白酶，37℃水浴中消化，每10 min震荡1次，组织块完全消失后收集消化悬浮液，添加细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM培养基)，离心后，添加培养液悬浮，种植到培养瓶内，放在37℃，5%CO2培养箱内，贴壁60 min后，吸除上清，加入细胞培养液继续培养。分离培养的细胞经波形蛋白免疫荧光鉴定呈阳性，结蛋白免疫荧光检测呈阴性，鉴定为心肌成纤维细胞。取第3代心肌成纤维细胞进行实验。

1.3AngⅡ处理的心肌成纤维细胞中TRIB3表达变化 心肌成纤维细胞分别用含0.0、0.1 μmol/L AngⅡ的培养液培养，记为空白对照组和AngⅡ组，细胞在培养24 h后用qRT-PCR和Western印迹法检测细胞中TRIB3表达变化。

qRT-PCR：收集空白对照组和AngⅡ组细胞，在细胞中添加总RNA提取试剂(TRIZOL)裂解液，按照RNA提取试剂盒步骤提取待测样品的RNA进行反转录，反转录步骤同cDNA合成试剂盒。按照SYBR qRT-PCR试剂盒进行定量PCR，记录每个反应的Ct值，按照2-△△Ct法计算TRIB3表达水平。GAPDH：上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。TRIB3：上游引物：5'-TGTCTTCAGCAACTGTGAGAGGACGAAG-3'，下游引物5'-GTAGGATGGCCGGGAG-CTGAGTATC-3'。

Western印迹法：收集空白对照组和AngⅡ组细胞，在细胞中添加RIPA裂解液，置于冰水混合物上裂解30 min后，用细胞刮刀收集细胞，4℃高速离心，吸取上清液并分装，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白。配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，将待测蛋白样品加入到上样缓冲液中，在100℃孵育3 min后，加入到上样孔内，每孔添加30 μg蛋白样品。100 V恒压电泳，观察Mark进入到分离胶的底部后，断开电源，进行转膜。100 mA电流转膜70 min，转膜温度控制在4℃。把转膜后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜取出，放在含有5%牛血清白蛋白封闭液的平皿中，室温中孵育30 min。再将PVDF膜放在TRIB3抗体孵育液中4℃过夜，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温孵育90 min后，电化学发光显色，分析每组样品目的蛋白TRIB3和内参蛋白GAPDH灰度值，以二者比值表示TRIB3蛋白水平。

1.4细胞分组和转染 心肌成纤维细胞中转染TRIB3 siRNA慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体，步骤如下：取心肌成纤维细胞，接种到24孔板内，细胞融合率为50%时，在细胞中添加慢病毒液，同时加入聚凝胺，培养20 h后换液，第3天观察荧光表达情况，以嘌呤霉素筛选后用于后续实验。把转染TRIB3 siRNA慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体的心肌成纤维细胞用含0.1 μmol/L的AngⅡ培养液培养记为TRIB3 siRNA组和siRNA-NC组，空白对照组、AngⅡ组处理方法同1.3。 AngⅡXEG 、siRNA-NCXEG 、TRIB3 siRNAXEG 细胞培养24 h后，用qRT-PCR和Western印迹法检测TRIB3 siRNA对AngⅡ条件下心肌成纤维细胞中TRIB3表达的干扰效果，步骤同1.3。

1.5噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 空白对照组、AngⅡ组、siRNA-NC组、TRIB3 siRNA组细胞分别接种到96孔板内，每孔加100 μl的细胞悬浮液(含5 000个细胞)，继续培养24 h后，每孔内加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h。弃上清，添加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，测定每孔490 nm的A值，以不含细胞的孔调零。

1.6羟脯氨酸法检测胶原合成 空白对照组、AngⅡ组、siRNA-NC组、TRIB3 siRNA组细胞分别培养24 h后，吸取培养液进行检测，准备测定管、空白管和标准管，空白管内添加500 μl的双蒸水，标准管内添加500 μl的标准应用液，待测管内添加500 μl的待测样品，每个管内加入50 μl的消化液，均匀混合后，37℃孵育3 h。按照试剂盒说明书在每管内加500 μl的试剂一，室温孵育10 min后，添加500 μl的试剂二，混合后，室温中孵育5 min，添加1 ml的试剂三，混合，60℃孵育15 min，冷却后，离心，吸取上清溶液，检测550 nm的A值，用蒸馏水调零，计算胶原含量。胶原含量=待测样品稀释倍数×标准管浓度×(待测管A值-空白管A值)÷(标准管A值-空白管A值)

1.7Western印迹法检测细胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表达 空白对照组、AngⅡ组、siRNA-NC组、TRIB3 siRNA组细胞培养24 h后检测细胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白水平，步骤同1.3。

1.8NO含量和iNOS活性变化检测 空白对照组、AngⅡ组、siRNA-NC组、TRIB3 siRNA组细胞培养24 h后，收集培养液上清，按照硝酸还原法检测各组培养液中NO含量，酶联免疫吸附试验检测培养液中iNOS活性。具体操作步骤参照试剂盒标准流程。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1AngⅡ诱导心肌成纤维细胞中TRIB3 mRNA和蛋白的表达 AngⅡ组心肌成纤维细胞中TRIB3蛋白和mRNA水平均明显高于空白对照组(P<0.05)。见图1、表1。

图1 Western印迹法检测AngⅡ处理后的心肌成纤维细胞中TRIB3蛋白表达

表1 AngⅡ处理后的心肌成纤维细胞中TRIB3表达变化

2.2TRIB3 siRNA对AngⅡ条件下心肌成纤维细胞中TRIB3蛋白和mRNA表达的影响 TRIB3 siRNA组心肌成纤维细胞经AngⅡ处理后，TRIB3蛋白和mRNA水平均明显低于AngⅡ组和siRNA-NC组(P<0.05)。见图2、表2。

图2 Western印迹法检测TRIB3 siRNA对AngⅡ条件下心肌成纤维细胞中TRIB3蛋白表达

表2 各组心肌成纤维细胞中TRIB3表达情况

与siRNA-NC组、AngⅡ组比较:1)P<0.05

2.3下调TRIB3抑制AngⅡ条件下心肌成纤维细胞增殖和胶原合成 与空白对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞A490值明显升高，同时培养液中胶原含量也明显升高(均P<0.05)。与AngⅡ组、siRNA-NC组比较，下调TRIB3后的TRIB3 siRNA组经AngⅡ诱导后，细胞A490值显著下降，培养液中胶原含量显著降低(均P<0.05)。见表3。

表3 心肌成纤维细胞A490值和培养液中胶原含量变化

AngⅡ组与空白对照组比较:1)P<0.05；与AngⅡ、siRNA-NC组比较:2)P<0.05；下表同

2.4下调TRIB3对AngⅡ条件下心肌成纤维细胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表达影响 与空白对照组比较，AngⅡ组COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平明显升高，MMP-2蛋白水平明显降低(均P<0.05)。与AngⅡ组和siRNA-NC组比较，TRIB3 siRNA组COLLⅠ、COLLⅡ蛋白水平降低，MMP-2蛋白水平明显升高(均P<0.05)。见图3、表4。

2.5下调TRIB3促进AngⅡ条件下心肌成纤维细胞分泌NO 与空白对照组比较，AngⅡ组NO含量、iNOS活性显著降低(均P<0.05)。与AngⅡ组、siRNA-NC组比较，TRIB3 siRNA组NO含量、iNOS活性显著升高(均P<0.05)。见表5。

1～4：空白对照组、AngⅡ组、siRNA-NC组、TRIB3 siRNA组图3 Western印迹法检测下调TRIB3对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白表达

表4 心肌成纤维细胞中COLLⅠ、COLLⅡ和MMP-2蛋白水平变化

表5 心肌成纤维细胞培养液中NO含量和iNOS活性变化

3 讨 论

心肌纤维化是各种类型心脏疾病发生的共同原因，心肌纤维化的发生与心肌间质细胞修复有关，其中心肌成纤维细胞是关键〔8,9〕。心肌成纤维细胞可以分泌胞外基质如COLLⅠ、COLLⅡ，进而参与组织重建过程，与此同时，心肌纤维化时心肌成纤维细胞合成的MMP-2等胶原降解酶减少也是心脏胶原沉积的重要原因之一〔10〕。AngⅡ是一种神经内分泌因子，在心肌纤维化过程中发挥主导作用，AngⅡ具有诱导心肌肥厚、心力衰竭等作用，持续的AngⅡ可诱发心脏内大量的胶原沉积，导致胶原体积变大，使心肌间正常组织结构受到破坏，引起心肌纤维化的发生〔11,12〕。AngⅡ刺激可诱导心肌成纤维细胞增殖并大量合成胶原〔13〕。本实验结果表明，AngⅡ处理后的心肌成纤维细胞增殖能力升高，细胞合成的胶原水平也升高，同时细胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表达水平升高，细胞中MMP-2蛋白水平下降，AngⅡ诱导心肌成纤维细胞纤维化发生，成功构建了心肌成纤维细胞纤维化模型。

TRIB3是在果蝇中发现的一种与胚胎发育有关的蛋白激酶，参与细胞应激反应，营养缺乏、缺氧等都可诱导TRIB3蛋白表达，TRIB3参与细胞增殖、凋亡、运动等多种功能调节过程〔14〕。目前对于TRIB3在细胞生长凋亡中的作用研究不同，在胰岛β细胞中的研究显示，TRIB3过表达可抑制高糖环境下的胰岛β细胞增殖〔15〕。在Corcoran等〔16〕的研究中表明，TRIB3可促进细胞增殖，减少细胞凋亡。TRIB3参与心肌纤维化过程，在心肌纤维化过程中表达上调，敲低TRIB3可减少高糖诱导的心肌成纤维细胞胶原合成，TRIB3在心肌纤维化中可能发挥促进作用〔5,17～19〕。本实验表明，敲低TRIB3可逆转AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成，减少细胞中COLLⅠ、COLLⅡ蛋白表达，促进MMP-2蛋白表达，敲低TRIB3能够通过降低AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖发挥抗纤维化作用。

NO是一种心肌纤维化调节因子，在心肌肥厚、心力衰竭等过程中发挥抑制作用，NO具有舒张血管的作用，在心肌纤维化过程中合成水平降低，NO水平的高低还与心肌成纤维细胞的增殖能力有关，iNOS是与组织损伤关系最为密切的iNOS，在心肌纤维化中活性降低〔20～24〕。本研究显示，AngⅡ抑制iNOS活性并减少心肌成纤维细胞合成的NO，而敲低TRIB3可逆转AngⅡ对心肌成纤维细胞iNOS活性和NO合成的影响，敲低TRIB3可能通过影响心肌成纤维细胞NO的合成发挥抗心肌纤维化作用。

综上，敲低TRIB3具有抗AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞纤维化作用，敲低TRIB3能够抑制心肌成纤维细胞增殖和胶原合成，敲低TRIB3还可促进心肌成纤维细胞合成NO。