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磷酸化α-突触核蛋白在C57BL/6J小鼠边缘叶与大肠中的增龄性变化及相关性

2019-07-04韩燕银朱明慧孔令东骆降喜田顺亮陈敏刘承伟于兰

中国老年学杂志 2019年13期
关键词:青年组结肠直肠

韩燕银 朱明慧 孔令东 骆降喜 田顺亮 陈敏 刘承伟 于兰

(1桂林医学院,广西 桂林 541004;2菏泽医学专科学校人体解剖学教研室;3桂林医学院附属医院)

帕金森病(PD)是临床上常见的一类神经系统变性疾病,也是中老年人最常见的锥体外系疾病。在典型的运动症状之前,PD还存在一系列复杂多样的非运动症状,其中消化系统功能紊乱是PD早期最常见的非运动症状之一〔1〕。

PD的主要病理学特点是黑质多巴胺神经元变性、缺失及路易小体(LBs)的形成,LBs的主要成分是Alpha-突触核蛋白(α-syn)〔2〕。α-syn是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质,与PD的发病机制和相关功能障碍密切相关,不仅使记忆减退、运动迟缓,而且α-syn聚集还可导致肠神经系统(ENS)异常,而ENS异常与消化功能紊乱密切相关〔3,4〕。研究显示,某些通常被认为病变部位在大脑的退行性疾病,如阿尔茨海默病(AD) 等,在大脑实质神经细胞外会出现淀粉样蛋白沉淀物即α-syn的聚集,在该患者胃肠道 ENS 中也会出现α-syn不同程度的聚集〔5〕。在PD患者脑内,在某些大脑神经元中出现的LBs也会在肠道神经元中出现,并且消化功能紊乱先于运动障碍发生,由此可见肠道 ENS 可能成为观察大脑状况的窗户〔6,7〕。

α-syn的主要毒性分子形式是寡聚化α-syn(O-α-syn),在寡聚化发生的过程中,α-syn S129位点磷酸化修饰后更易聚集为寡聚化状态〔8,9〕。当脑内神经元α-syn 聚集达到一定程度时,其运动状态会发生改变。随着年龄的增加,老化成为神经退行性疾病发生的关键因素之一〔10〕。大脑边缘叶是内脏活动的高级中枢,但α-syn在边缘叶中的聚集程度和在肠神经节中的变化规律尚不清楚。

1 材料与方法

1.1材料 健康C57BL/6J小鼠青年(2个月)、中年(8个月)、老年(24个月)各5只,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验动物许可证号:SCXK(湘)2016-0002。饲养条件:在桂林医学院SPF级动物中心,小鼠适应环境1 w后,单笼饲养,温度22~24℃,相对湿度适宜,自由摄食与饮水,自动光控12 h明暗周期。兔抗人磷酸化(P)-α-syn单克隆抗体(Santa Cruz公司,美国),辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG、生物素化的鼠单克隆抗体(康为世纪标记公司)。

1.2方法

1.2.1动物行为学测试 通过平衡杆实验、爬杆实验和旷场实验观察不同年龄段小鼠平衡力、肌力、抓力、运动能力和协调能力等行为学的改变。每只小鼠先进行适应性训练,然后开始正式测试。

1.2.2Western印迹检测

1.2.2.1组织匀浆的制备 断头处死小鼠后,取结肠、直肠一部分及大脑边缘叶并立即置于液氮中速冻,然后转移到-80℃冰箱中保存。将结肠、直肠和边缘叶在加有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中研磨、裂解,12 000 r/min、4℃离心30 min,取上清,采用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific公司,美国)根据说明书测定蛋白质浓度。

1.2.2.2α-syn水平检测 BCA定量后的蛋白加入一定体积的上样缓冲液,使用聚偏二氟乙烯膜(PVDF),12.5%分离胶,一抗稀释浓度分别为β-actin 1∶5 000(冠星宇,北京)、P-α-syn 1∶1 000,二抗稀释浓度分别为HRP抗鼠IgG 1∶5 000、HRP抗兔IgG 1∶5 000,化学发光试剂(ECL)发光显影(Thermo Pierce公司,美国)。

1.3统计学方法 使用ImageJ软件分析Western印迹条带灰度值,使用SPSS18.0软件统计,通过GraphPad Prism 6软件分析数据并绘图,多组间计量资料比较用方差分析,两组间比较用独立样本t检验,相关性用Pearson分析。

2 结 果

2.1行为学结果 随着年龄的增加,老年组、中年组、青年组小鼠在平衡杆、爬杆、旷场实验中的表现均有统计学差异。青年组、中年组、老年组小鼠平衡杆和爬杆实验所用时间逐渐增加,各组间差异显著(P<0.001);旷场实验结果显示,青年组、中年组、老年组小鼠单位时间内的速度逐渐降低,各组间差异显著(P<0.001);行为学测试中,老年组出现轻微的运动迟缓、步态不稳定、反应迟缓等表现。见表1。

表1 各组平衡杆实验、爬杆实验所用时间及旷场实验的速度比较

与青年组比较:1)P<0.01,2)P<0.001

2.2Western印迹检测结果

2.2.1结肠P-α-syn的表达情况 随着年龄的增加,小鼠结肠P-α-syn的表达出现增龄性变化;青年组(0.675 4±0.126 2)、中年组(1.669 9±0.050 2)、老年组(2.240 4±0.060 7)结肠中P-α-syn的表达水平随着年龄的增加而增多,各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2.2直肠P-α-syn的表达情况 随着年龄的增加,小鼠直肠P-α-syn的表达出现增龄性变化;青年组、中年组、老年组直肠P-α-syn的表达水平随着年龄的增加逐渐增多,青年组(1.425 6±0.431 1)与老年组(3.681 9±0.113 4)、中年组(1.744 8±0.189 9)与老年组直肠P-α-syn表达均有显著差异(P<0.01)。见图2。

图1 各组结肠P-α-syn的表达情况

图2 各组直肠P-α-syn的表达情况

2.2.3大脑边缘叶P-α-syn的表达情况 随着年龄的增加,小鼠边缘叶P-α-syn的表达出现增龄性变化;青年组、中年组、老年组大脑边缘叶P-α-syn的表达水平随着年龄的增加而增多,青年组(0.083 9±0.013 1)与老年组(0.626 1±0.038 6)、中年组(0.107 8±0.016 4)与老年组边缘叶P-α-syn的表达差异均具有统计学意义(P<0.01),见图3。

图3 大脑边缘叶P-α-syn表达情况

2.3结肠、直肠与大脑边缘叶中P-α-syn含量的相关性分析 结肠、直肠中P-α-syn浓度与边缘叶P-α-syn的表达均呈显著正相关,图4。

图4 C57BL/6J小鼠结肠、直肠与边缘叶P-α-syn表达量的相关性分析

3 讨 论

PD典型的运动症状是肌张力增高、运动不协调等〔11〕。有研究发现,PD 患者出现运动症状前,肠神经已经出现 α-syn 异常沉积而导致肠神经受损,进而导致肠道内环境紊乱产生体内慢性低度炎症刺激〔1〕。肠壁神经系统在慢性炎症作用下出现类 PD 的病理改变(即α-syn沉积),肠神经及肠黏膜受损,导致肠功能障碍〔12,13〕。而老龄化也是PD发病的危险因素〔14〕。在老化过程中,负责启动和调节运动输出到骨骼肌肉系统的体细胞运动神经系统容易老化〔15〕,黑质纹状体多巴胺途径是该系统的一个组成部分,因此,多巴胺信号传导障碍会导致主要运动功能障碍。研究证实,上述增龄性老化过程与大肠和大脑中的α-syn聚集有关〔16,17〕。α-syn发生聚集的主要原因是其磷酸化,α-syn磷酸化水平增高导致其更易聚集为P-α-syn,其细胞毒性也明显增高,从而导致多巴胺能神经元的变性坏死〔18〕。本研究结果提示,随着年龄的增加,消化道肠神经节P-α-syn表达量增加可能与小鼠内脏活动高级中枢边缘叶的表达量有关。

临床上,PD的发病过程中,便秘、消化不良等消化道症状通常发生于运动障碍之前。本研究也发现,随着年龄的增加,C57BL/6J小鼠的结肠、直肠及边缘叶P-α-syn的聚集逐渐增多,运动逐渐迟缓。因此,笔者推测PD患者一些胃肠道症状与P-α-syn聚集具有密切的相关性。由于非运动症状发生早于运动症状,而肠道与大脑边缘叶中P-α-syn的表达具有相关性,提示能否通过改善肠道功能、增强运动锻炼等方式降低P-α-syn在脑中的聚集,达到对PD的预防和治疗作用。

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