离子色谱法检测胶红酵母R.mucilaginosa C I CC 33013胞外多糖的单糖组成

马文锦，李梅林，王 博，张永显，于长青，班省华

（甘肃省轻工研究院有限责任公司，甘肃兰州 730030）

0 引言

胶红酵母（R.mucilaginosa） 是酵母种属的一种，研究发现胶红酵母富含虾青素、β-胡萝卜素和β-葡聚糖，其可以将糖蜜、三乙醇胺、二乙醇胺和一些简单的芳香族化合物作为满足自身生产的氮源[1-2]。酵母菌胞外多糖（Extracellular polysaccharides，E PS）是由酵母细胞产生的，分布于细胞壁之外，以荚膜的形式附到细胞壁上或以黏液的形式分泌于胞外环境的同多糖或异多糖[3]，与植物多糖、动物多糖等其他来源的多糖相比，酵母胞外多糖最大的优势在于易于分离纯化，可连续化发酵，不受地域、季节等环境的影响。因此，研究酵母胞外多糖具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。

近年来，随着糖生物学和糖化学的发展，多糖的生物活性越来越受到人们的重视，市场上出现了很多多糖类药品、食品和保健品，对这些产品的品质控制也就越来越重要。由于单糖是构成多糖的基本单元，因此单糖组成分析是基础性和关键性的研究环节。目前，关于单糖组成的测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法和离子色谱法。由于糖链没有紫外或者荧光基团，采用高效液相色谱法时，需将样品水解后进行柱前或柱后衍生化处理，使糖链带上紫外或者荧光基团，极性发生改变，但该方法繁琐耗时且灵敏度低[4-5]。气相色谱法检测单糖时，虽然灵敏度较高，但是也要对其衍生化处理，由此容易产生异构体，使一种糖产生几个色谱峰，对组分的分离与定量产生影响[6-7]。毛细管电泳法由于对常见糖类的紫外吸收较弱，也需经过衍生后才能使得糖类达到足够的灵敏度[8-9]。而离子色谱法最大的优点就是样品不需要衍生处理，就能分析几乎所有的单糖和大部分的寡糖及低聚糖[10-12]，已经得到越来越广泛的应用。通过离子色谱法检测了胶红酵母胞外多糖的单糖组成，为常见多糖组成中单糖的定性定量分析提供了快速可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胶红酵母菌株，中国典型培养物保藏中心提供；葡萄糖，天津市凯信化学工业有限公司提供；阿拉伯糖，广州苏喏化工有限公司提供；D-半乳糖，南京化学试剂股份有限公司提供；核糖、木糖、果糖、甘露糖，合肥博美生物科技有限责任公司提供；三氯乙酸，国药集团化学试剂有限公司提供；甲醇，海南得益化工贸易有限公司提供。

Y C3000型离子色谱仪，青岛埃仑色谱科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 单糖标准溶液配制

分别配制质量浓度均为1.00 mg/mL的阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、D-半乳糖等7种单糖的储备液。

1.2.2 胶红酵母胞外多糖中单糖组分的测定

试验前期通过醇沉、脱蛋白、透析等方法得到胶红酵母R.mucilaginosa CICC 33013菌株代谢的胞外多糖RE PS，复溶后经D EAE-52纤维素层析和Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化得到多糖组分RE PS2-A，高效液相凝胶渗透色谱法法测得其呈单一、对称峰，表明得到的多糖组分RE PS2-A是均相样品。

在已有方法[13]的基础上进行改进。具体操作为:精确称取5.00 mg多糖组分RE PS2-A溶解于浓度为2.5 mol/L的三氟乙酸中，在121℃下保存2 h，采用N2气流对其风干。风干后的样品用甲醇进行近一步萃取、洗涤，并用N2气流对其风干，循环3～4次；得到的干样品用1.00 mL的蒸馏水溶解，溶解后稀释100倍，取25μL样液采用离子色谱进行分析，用P A D软件做出相应的峰图。设定条件如下:流动相为氢氧化钠，流速梯度为 0～40 min，5 mmol；40～45 min，100 mmol；45～50 min，200 mmol；50.2～55.0 min，5 mmol；其中40～45 min内同时加入100 mmol的醋酸钠，流速设定为1 mL/min，上样量25μL，柱温30℃，柱型为Carbo Pac-P A10。

2 结果与分析

单糖标准图谱见图1。

由图1可知，在上述试验操作下，阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖依次出峰，并且获得了较好的分离效果。

多糖组分RE PS2-A的单糖组成谱图见图2。

图1 单糖标准图谱

图2 多糖组分R E PS2-A的单糖组成谱图

由图2可知，由出峰时间和峰面积可得，RE PS2-A由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖4种单糖组成，摩尔比为0.2∶63.1∶18.3∶18.3。其中，半乳糖的含量占到50%以上，阿拉伯糖含量最低。

3 结论

建立了一种快速、灵敏度高的适合检测多糖中单糖组分的定性定量分析方法，为阐明胶红酵母R.mucilaginosa CICC 33013胞外多糖的结构组成及其活性提供技术支撑及基础数据。此方法与传统方法相比，消除了非糖类成分的干扰，提高了检测的专属性，结果更加真实，同时为其他类多糖的质量控制提供了借鉴[14-15]。