高效液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中胆碱L-肉碱含量方法研究

2019-06-25詹越城刘梦婷汪庆旗

农产品加工 2019年12期

詹越城，何斌，刘梦婷，杨娜，汪庆旗，杨琳

（1.浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310000；2.浙江赞宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

胆碱是哺乳动物生长过程中不可或缺的一种水溶性维生素，它在生物体内具有不可替代的基本功能。虽然人体和哺乳动物具有合成胆碱的功能，但大量研究表明人体也需要膳食胆碱。胆碱以氯化物或酒石酸氢盐的形式用于婴幼儿配方食品的强化。当体内胆碱不足时，表现为生长受阻、营养不良、繁殖能力差和脂肪肝等。试验证明，在婴幼儿时期摄入适量的胆碱能够帮助提升宝宝的记忆能力。L-肉碱是一种相对分子质量较小的类蛋白质分子，是促进脂类代谢的重要物质。若体内缺乏L-肉碱，会造成细胞能量代谢的紊乱，从而引起肌肉无力、疲劳和大量脂肪的堆积。L-肉碱对婴儿体内脂肪代谢至关重要，有助于婴儿保持体温，且有助于早产儿发育，被视为婴儿必需营养元素。成年人所需的胆碱、L-肉碱可由自身合成，亦可通过食物进行补充。但婴幼儿各种功能未发育完全，自身合成量非常有限，绝大部分需通过食物得到补充[1-3]。

目前，对于胆碱的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、离子色谱法、酶法和化学发光法等，L-肉碱的检测方法主要有酶显色法-分光光度法、酶-荧光法、高效液相色谱法、离子色谱法等[4-5]。国家标准中对胆碱和L-肉碱的测定方法为分光光度法，该操作较为繁琐、耗费时间长、检测灵敏度不高。试验采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方食品中胆碱和L-肉碱含量，具有操作简单、检测灵敏度高、重现性好、抗干扰性强等优点。

1 试验设计

1.1 仪器与试剂

乙腈、甲酸均为色谱纯，美国TE DIA公司提供；冰乙酸（分析纯），杭州化学试剂有限公司提供；水为GB/T 6682规定的一级水。

胆碱，L-肉碱标准物质（含量≥99%），均购于德国D r.Ehrenstorfer公司。

Agilent6470型液相色谱串联三重四极杆质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源，美国Agilent公司产品；AR2140型电子分析天平、KS-300EI型超声波清洗器，宁波海曙科生超声设备公司产品；Centrifug-5804R型台式离心机，德国Eppendorf产品；M illi-Q型纯水仪，美国M illpore公司产品。

1.2 溶液的配制

标准溶液的配置:将上述标准物质各称取0.10 g至50.00 mL容量瓶，用水溶解并定容，再用水溶液稀释成系列标准工作液（现配现用）。

1.3 样品制备

称取奶粉1.00 g于100 mL容量瓶中，加入60 mL 45～50℃水溶解，振荡混匀2 min，超声提取30 min，待溶液温度降低至室温。向上述溶液中加入0.1 mL冰乙酸，用水定容至刻度，混匀。取30 mL至50 mL离心管中，以转速4 000 r/min离心5 min，取上清液1.00～25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，经0.22μm滤膜过滤后，上仪器进行测定。

1.4 分析条件

色谱条件:色谱柱:O SAKA S OD A PC HILIC（5μm，2.0 mm×100 mm）；流速0.6 mL/min，柱温40℃，进样量2μL；流动相A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈；流动相比例A/B=90/10（V/V）质谱条件:离子源电喷雾离子源（ESI+）喷雾压力40 psi；干燥气流速10 L/min，干燥气温度350℃，毛细管电压4 000 V。

胆碱和左旋肉碱的质谱优化条件见表1。

表1 胆碱和左旋肉碱的质谱优化条件

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

选择ESI正离子模式，质谱条件的优化用直接接二通方式进行，用0.3 mL/min的流速将质量浓度1μg/mL胆碱和左旋肉碱标准溶液注入电喷雾离子源，进行一级质谱分析得到相应的分子离子峰，对分子离子峰进行二级质谱（子离子）扫描，获得二级质谱信息，然后对裂解电压及碰撞能进行优化，使分子离子和特征子离子强度达到最佳，然后进一步优化毛细管电压、雾化器压力、干燥器温度和流速等质谱参数使离子化效率达到最佳。

2.2 色谱条件的优化

胆碱和左旋肉碱都属于大极性亲水化合物，在常规C18色谱柱上很难保留，因此需要选用亲水性色谱柱进行分离。试验比较了HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm）和P C HILIC（2.0 mm×100 mm，5μm）的分离效果。结果发现，2种色谱柱对胆碱和左旋肉碱保留和分离效果都不好，但是P C HILIC保留时间更加稳定、分离效果也较好，因此选用P C HILIC色谱柱。

因采用ESI正离子模式，流动相多使用质量分数0.1%甲酸水-乙腈，质量分数0.1%甲酸水-甲醇，浓度5 mmol/L乙酸铵-乙腈，浓度5 mmol/L乙酸铵-甲醇。结果显示，使用质量分数0.1%甲酸水-乙腈作为流动相时，目标物响应和峰形都较好。

2.3 样品提取方法的条件

婴幼儿配方奶粉中含有很多水溶性成分和脂溶性营养成分，基质比较复杂。其中脂溶性营养成分不溶于水，而胆碱和左旋肉碱水溶性良好，可用温水直接提取。所以在用水提取后，沉淀溶于水中的蛋白质就可以了。试验考查了乙腈、乙酸、三氯乙酸、亚铁氰化钾/乙酸锌等沉淀剂对婴幼儿配方奶粉中蛋白质的沉淀效果。结果发现，用乙腈沉淀蛋白质不完全，离心过滤后样品溶液不澄清，检测峰形较差；亚铁氰化钾/乙酸锌沉淀剂沉淀效果好，但是对左旋肉碱有影响，回收率较差；三氯乙酸和乙酸沉淀蛋白质完全，样品溶液过滤后澄清，目标物检测峰形较好。从操作的便捷性和安全性考虑，试验采用冰乙酸作为蛋白质沉淀剂。

试验比较了振荡提取与超声提取2种方法，结果表明，单纯振荡提取需要时间较长。振荡1 min后超声30 min提取效率高、提取效果好。