mRNA稳定因子HuR通过cyclinD1的靶向作用对人乳腺癌MCF-7细胞株行为的影响

郑克思 郑翔 曾勇 陈聪 吴元肇 郑克文

乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，在全球范围内，其发病率均呈大幅上升趋势，但随着生物技术的发展，新型靶向药物研制的成功，使乳腺癌患者的预后得到很大的改善[1]。但乳腺癌作为一种异质性肿瘤，各亚型在自然病程和治疗反应方面差异较大，因此继续寻找一种特异性生物标志物应用于乳腺癌预后的判断及新型靶向药物的研制，已经成为乳腺癌治疗的一种必然。目前大量的研究表明，肿瘤的发生、发展与细胞周期调控异常有关，而细胞周期特异性蛋白D1（cyclin D1）是调控细胞周期的关键蛋白，已被证实为原癌基因，其过度表达可以导致细胞的恶性转化。而在肿瘤中，人抗原R（HuR）作为一种RNA结合蛋白，主要通过基因的转录后调节机制调节靶基因的表达，进而调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、血管生成和淋巴管生成等过程。相关研究表明，在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤组织中均能检测到HuR、cyclinD1的过表达[2-7]。本文以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，探讨HuR通过cyclinD1对乳腺癌细胞行为的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料 MCF-7人乳腺癌细胞株（武汉普诺赛公司）；RPMI 1640细胞培养液、胰蛋白酶、FBS、1%青链霉素（美国Gibco公司）；pU6gRNACas9EGFP载体及pIRES2-ZsGreen载体（美国 Addgene公司）；LipofectamineTM2000转染试剂、TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Xho I、EcoR I（大连 Takara公司）；DNA 胶回收试剂盒（上海生工公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MTT检测试剂盒（上海碧云天公司）；细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司）；HuR抗体、cyclin D1抗体；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、HRP标记羊抗兔二抗（武汉三鹰公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将MCF-7细胞放在含有10%FBS和1%青链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并置于37℃、5%CO2环境下生长。细胞融合至80%左右时常规传代。将MCF-7细胞分为对照组、HuR过表达组（构建HuR过表达载体并转染）、HuR敲低组（构建HuR敲低载体并转染）。

1.2.2 HuR过表达载体的构建与转染 按照TRIzol试剂盒说明书提取MCF-7细胞的总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板进行PCR扩增：Premix Taq 12.5μl、上下游引物各 1μl、模板 2μl、加 ddH2O 至 25μl的反应体系。反应条件为 94℃ 5 min，94℃ 30s，61℃30s，72℃ 2min，共 30 个循环，72℃延伸 10min，电泳后切胶回收HuR基因片段。用限制性内切酶Xho I、EcoR I将回收的HuR片段与载体pIRES2-ZsGreen分别进行双酶切，将酶切产物用T4 DNA连接酶构建HuR过表达载体，并进行DNA测序鉴定。

1.2.3 HuR敲低载体的构建 使用CRISPR在线设计工具（http://crispr.mit.edu/）设计HuR基因的 gRNA（序列：5′-AGAGCGATCAACACGCTGAA-3′；上海吉玛制药技术有限公司合成），退火成双链后，连接克隆到经Bbs I酶切的pU6gRNACas9EGFP载体上。然后转化到感受态的大肠杆菌DH5α后，挑单克隆提取质粒和测序分析，验证得到正确克隆的质粒。

1.2.4 荧光定量PCR检测HuR、cyclinD1 mRNA的表达 细胞转染48h后分别收集HuR过表达组和HuR敲低组细胞，同时收集对照组细胞。按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞的总RNA，反转录获得cDNA，以此cDNA为模板进行荧光定量PCR。选取GAPGH作为内参，利用2-ΔΔCT相对定量法测定并计算HuR、cyclinD1 mRNA的相对表达量。各基因引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.2.5 Western blot检测 HuR、cyclinD1蛋白的表达细胞转染48h后分别收集对照组、HuR过表达组、HuR敲低组细胞，细胞裂解液4℃裂解，12 000r/min离心30min，吸取上清液获取总蛋白。根据BCA蛋白定量结果上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳2.5h，转膜后NC膜TBS稍荡洗，5%脱脂奶粉室温封闭1h，4℃下分别孵育HuR、cyclinD1一抗过夜，TBST洗10min×3次，室温孵育二抗1h，TBST洗10min，重复3次，曝光显影；采用BIO-RAD Image Lab软件进行灰度值分析。

1.2.6 MTT检测细胞增殖活性 细胞转染48h后进行MTT检测。将对照组、HuR过表达组、HuR敲低组细胞接种于96孔板。每孔加入10μl MTT，37℃孵育4h，吸出培养基，加入150μl DMSO震荡10min，酶标仪测定各孔在波长568nm下的吸光度值（OD）。

1.2.7 Annexin V－APC/7－AAD双染检测细胞凋亡率细胞转染48h后分别收集对照组、HuR过表达组及HuR敲低组的细胞。预冷PBS洗2～3次，调整细胞浓度至 5×105/ml，加入 100μl Binding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V－APC 和 5μl 7－AAD 染液混匀，避光室温孵育 10min。再次加入 400μl 1×BindingBuffer。然后样品于流式细胞仪检测分析。

1.2.8 Transwell实验检测细胞迁移 细胞转染48h后分别收集对照组、HuR过表达组及HuR敲低组的细胞。用无血清培养基稀释细胞浓度至2×105/ml。在24孔板中加入800μl 10%含FBS培养基，并放入transwell小室，在transwell上室分别接入200μl各组细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱培养 48h。取出 transwell，用 PBS 小心清洗小室1遍，用70%冰乙醇溶液固定细胞1h。用0.5%结晶紫染液染色，室温中放置20min，PBS清洗，用干净的棉球将上室一侧未迁移的细胞擦干净，显微镜下观察拍照，计数细胞数量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HuR过表达载体及敲低载体构建 构建的HuR过表达及敲低载体经测序分析表明插入的序列及位点正确，目的基因HuR的过表达及敲低载体质粒构建成功，见图1。

图1 HuR过表达载体及敲低载体质粒测序鉴定（a：HuR过表达载体部分测序结果；b：HuR敲低载体部分测序结果）

2.2 HuR对MCF－7细胞增殖的影响 见图2。

图2 HuR对MCF-7细胞增殖的影响（与对照组比较，**P＜0.01）

由图2可见，与对照组比较，HuR过表达组细胞的增殖率显著增加（t=－18.29，P＜0.01），HuR敲低组细胞的增殖率显著降低（t=13.83，P＜0.01）。

2.3 HuR对MCF－7细胞迁移的影响 见图3。

图3 HuR对MCF-7细胞迁移的影响（a：对照组MCF-7细胞的HE染色图，b：HuR过表达组MCF-7细胞的HE染色图，c：HuR敲低组MCF-7细胞的HE染色图，×200；d：各组细胞迁移数量的柱形图，与对照组比较，*P＜0.05）

由图3可见，与对照组比较，HuR过表达组细胞的迁移数量增加（t=－4.57，P＜0.05），HuR 敲低组细胞的迁移数量降低（t=3.91，P＜0.05）。

2.4 HuR对MCF－7细胞凋亡的影响 见图4。

由图4可见，与对照组比较，HuR过表达组细胞的凋亡率显著降低（t=3.70，P＜0.05），HuR敲低组细胞的凋亡率显著升高（t=－45.32，P＜0.01）。

2.5 HuR对cyclinD1表达的影响 见图5。

由图5可见，与对照组比较，HuR过表达组细胞中HuR、cyclinD1蛋白表达水平显著升高（t=－10.55、－6.75，均P＜0.01），HuR敲低组细胞中HuR、cyclinD1蛋白表达水平显著降低（t=21.35、4.33，P＜0.05 或 0.01）。与对照组比较，HuR过表达组细胞中HuR、cyclinD1 mRNA表达水平显著升高（t=-11.70、-9.34，均P＜0.01），HuR敲低组细胞中HuR、cyclinD1 mRNA表达水平显著降低（t=21.88、9.55，均P＜0.01）。

图4 HuR对MCF-7细胞凋亡率的影响（注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

HuR是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉（ELAV）家族的重要一员，其基因在机体各组织中广泛表达，通过调控靶mRNA的稳定性和（或）翻译效率来影响靶基因在细胞中的表达水平，而且这种调控多以正向调控为主，从而参与细胞生命活动的调控[8-12]。在生理状态下，HuR主要定位在细胞核，功能是与靶基因的mRNA结合形成复合物，穿梭到胞质，在此过程中HuR保护mRNA避免衰变降解；在病理状态下，HuR胞质表达增加，阻止含AREs靶基因脱腺苷化降解过程，延长mRNA的寿命，使其蛋白异常增加[8-12]。近年来研究表明，HuR与人乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌和胃癌的发生、侵袭及转移有关，可能是影响胃癌、乳腺癌、大肠癌等预后的因素[2-7]。2005年，Heinonen等[13]发现胞质HuR表达与HER2阴性、PR和ER阳性、p53表达、癌肿的分级及管状分化表型相关，并发现HuR在细胞质中的高表达可以作为浸润性导管乳腺癌诊断的分子标志。在本研究中，HuR过表达组细胞的增殖率和迁移数量显著增加，细胞凋亡率降低；HuR敲低组细胞的增殖率和迁移数量显著降低，细胞凋亡率显著升高。表明HuR可以促进人乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁移活动，降低MCF-7细胞的凋亡。

图5 HuR对cyclinD1表达的影响（a：各组HuR、cyclinD1蛋白表达水平柱状图；b：各组HuR、cyclinD1 mRNA表达水平柱状图；c：各组HuR、cyclinD1 蛋白电泳图。注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

细胞增殖呈周期性变化，增值周期中有多个调控点，其中最重要的是起始调控点即G1-S间的前期调控点，此点主要由cyclinD1决定，当受生长因子刺激cyclinD1增多，与CDK4/CDK6结合使其活化为蛋白激酶，使Rb蛋白磷酸化，Rb蛋白磷酸化后构象改变而转录因子E2F分离使其发挥强大的转录作用使细胞增殖[14-15]。大量研究表明，肿瘤的发生与细胞周期调控异常有关，cyclinD1已被证实为原癌基因，它们的过度表达或错误调控均可导致细胞的恶性转化[14-15]。目前研究cyclinD1含295氨基酸，由染色体上11q13上的CCND1基因编码，动物模型和细胞培养表明cyclinD1蛋白过度表达可使细胞周期缩短，对分裂原的依赖性减弱[14-15]。有人应用基因转染技术cyclinD1 cDNA导入生育期小鼠中，发现乳腺组织CCND1扩增，其中8只小鼠发展为乳腺癌并不同程度合并其他肿瘤，证明了CCND1作为原癌基因在乳腺癌形成过程中起重要的促进作用[16]。在乳腺癌细胞培养中Buckley观察了20种癌细胞系，发现25%的样本存在cyclinD1基因的表达升高，45%的样本其mRNA水平较正常高[17-18]；而乳腺癌研究中发现大约一半的浸润癌cyclinD1蛋白的表达水平高于正常上皮，cyclinD1可作为乳腺癌肿瘤标记之一[17-18]。胡向阳等[19]用免疫组化的方法检测发现乳腺癌中cyclinD1表达阳性率显著高于良性乳腺组织，cyclinD1表达出现于导管内癌并持续于浸润转移等过程中，与年龄、肿瘤大小、组织学类型等无相关性，但与组织学分级呈负相关。O′Connor等[20]报道cyclin D1在乳腺癌中的过表达与预后呈正相关。

HuR参与细胞周期的调控，研究表明，HuR蛋白能够通过转录后调控机制调节 p21、p27、cyclinA、cyclinB1、p53等多种与细胞周期相关的基因在细胞中的表达[21-24]。在肺癌细胞的研究中发现，猪苓多糖能通过HuR介导的转录后途径调控A549细胞cyclin D1表达[25]。在人肾脏系膜细胞中，研究表明在血管紧张素Ⅱ刺激下可促使胞核内HuR蛋白向胞质内转移增强cyclinD1蛋白表达进而刺激人肾小球系膜细胞增殖[26]。细胞周期蛋白可分为3类：S期周期蛋白，M期周期蛋白，G1期周期蛋白。S期周期蛋白为cyclin A，M期周期蛋白为cyclin B，G1期周期蛋白为cyclin C、D、E。相关文献表明HuR能调控各周期蛋白的表达，Guo等[27]发现微小RNA可以通过HuR调节cyclin E1在乳腺癌中的表达，Schroeder等[28]发现在细胞增殖过程中HuR调控cyclin A和cyclinB1 mRNA的稳定性。在本研究中，cyclinD1在HuR过表达组细胞中表达显著升高，在HuR敲低组中显著降低，提示HuR可能通过上调cyclinD1的表达，影响细胞周期，从而促进MCF-7细胞的恶性生物学行为。

本研究以荧光定量PCR及Western blot检测HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表达水平，结果显示与对照组比较，HuR过表达组细胞中HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表达水平显著升高，HuR敲低组细胞中HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表达水平显著降低，提示HuR与cyclinD1在乳腺癌演进过程中有协同作用。目前研究认为转录后调节mRNA产物的最具特征性的顺式作用元件是AREs（富含腺嘌呤A和尿嘧啶U的序列），定位在许多不稳定mRNA的3′非翻译保守区（3′UTR），而在HuR蛋白上有3个RNA识别模序（RRMs），可以与AREs特定位点结合[8-12]。HuR作为一种mRNA结合蛋白，连接于3′UTR含有AREs的短寿命mRNA，可以抑制该mRNA的快速衰变降解，从而增强其转录后翻译的能力[8-12]。HuR蛋白已被证实可以通过转录后调控机制调节 cyclinA、cyclinB1、c-fos、VEGF、TNF-α、β 连接素（β-catenin）、c-Myc、COX-2、myogenin、MyoD、GMCSF、p21、p27、p53 与 HSP70 等多种基因在细胞中的表达，而相关的研究显示这些基因的mRNA都富含AREs[21-24]。目前cyclinD1基因的mRNA亦被证实富含AREs，提示cyclin D1的过表达可能是通过HuR稳定其mRNA实现的。

综上所述，HuR可能通过上调cyclinD1的表达，影响细胞周期，从而促进MCF-7细胞的恶性生物学行为。因此，HuR、cyclinD1基因可能为乳腺癌的新治疗靶点。