siRNA沉默CD44表达对人胆囊癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

蔡炜龙 余胜 汪伟民 许洪宝 楼能

胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，5年生存率低于5%[1]。由于胆囊癌早期症状并不显著，易被忽略，且胆囊癌的进展较快，易发生远处转移，发现时多处于晚期，失去治疗的机会[2-3]。CD44是一种透明质酸受体，参与细胞黏附、淋巴细胞迁移、归巢等过程[4]。近年来越来越多的研究开始关注CD44的功能，研究发现CD44在前列腺癌、三阴性乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，并且CD44的异常表达与恶性肿瘤的预后相关[5-8]。而CD44在胆囊癌中的表达及其作用研究报道较少。本研究拟通过观察CD44对人胆囊癌细胞株EH-GB1和GBC-SD增殖、侵袭和迁移的影响，探讨CD44对胆囊癌细胞的作用，为防治胆囊癌寻找可能有效的治疗靶标。

1 材料和方法

1.1 细胞培养 人胆囊癌细胞株EH-GB1和GBC-SD由中国科学院上海生命研究院细胞资源中心提供。用10%DMEM培养基并加入1%的链霉素和青霉素，置于5%CO2培养箱、37°C 培养。

1.2 试剂与耗材 CD44抗体、兔二抗购自美国CST公司，培养基购自美国Gibico公司，CCK8试剂盒、结晶紫、BCA试剂盒等购自上海碧云天生物科技有限公司,siCD44购自上海拓然生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组和转染siRNA 分别将EH-GB1和GBCSD细胞分为阴性对照组（si-NC组）和siRNA干扰技术沉默CD44实验组（si-CD44组），si-NC组转染si-NC，si-CD44组转染si-CD44。分别将GBC-SD和EH-GB1铺于6孔板内，24h后，根据说明书，用Lipofectamine 2000转染胆囊癌细胞，每6孔板内转染50nmol siRNA，转染6h后，更换培养基继续培养。待48h后收集胆囊癌细胞进行后续实验。

1.3.2 CCK8细胞生长实验 将转染后的细胞常规消化、离心、重悬后计数，将细胞接种于96孔板内，每孔细胞数1 000个，每组处理细胞设置4个复孔，放于细胞培养箱内孵育。分别于6h、第1、2、3、4、5天加入10%CCK8，37°C避光孵育2h后，用酶标仪检测450nm时的吸光度（OD）值。以上实验重复3次。

1.3.3 Transwell侵袭、迁移实验 Transwell小室实验分为迁移小室实验和侵袭小室实验，前者无基质胶而后者有基质胶。实验前将Transwell侵袭小室置于24孔培养基内水化。将转染后的细胞常规消化、离心，用无血清DMEM培养基重悬后计数。在Transwell小室上室内加入 200μl（2万个细胞）培养基，下室加入 500μl 10%DMEM，孵育24h。取出Transwell小室，吸走小室内培养基，向下室加入多聚甲醛，室温固定20min，然后加入0.1%结晶紫染色，室温染色20min，擦掉未迁移的细胞后晾干，显微镜下计数5个不同视野的细胞数。

1.3.4 Western blot实验 胆囊癌细胞经过转染si-CD44 48h后，弃上清液，用PBS清洗2次，加入RIPA细胞裂解液裂解20min，进行离心。利用BCA试剂盒检测蛋白浓度。样品加入6×蛋白上样缓冲液煮沸变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳，随后进行转膜。转膜结束后，用5%脱脂奶费常温封闭1h，随后在一抗4℃孵育过夜，第2天用TBST进行洗膜，孵育二抗1h。结束后，用电化学发光仪进行显影、曝光。

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件，所有实验数据均为3次重复实验的平均值，计量资料以表示，两组比较用采用Student’t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染si-CD44后两组细胞内CD44的表达情况见图1。

图1 转染si-CD44后两组细胞CD44表达情况比较（a：蛋白表达电泳图；b：RT-PCR结果比较，与si-NC组比较，**P＜0.01）

由图1可见，与si-NC组相比，si-CD44组的条带明显变细，表明其CD44蛋白表达量明显降低，siRNA基因沉默效果好（图1a）；通过RT-PCR再次验证，si-CD44组中CD44表达量明显低于si-NC组，差异有统计学意义（P＜0.01），进一步表明si-CD44组基因沉默效果好（图1b）。

2.2 转染si-CD44后两组细胞增殖情况 见表1、2及图2。

由表1、2及图2可见，EH-GB1和GBC-SD细胞转染si-CD44后，CCK8增殖实验表明，与si-NC组相比，si-CD44组的增殖无明显变化，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 转染si-CD44后两组细胞迁移情况 见图3。

由图3可见，Transwell小室细胞迁移实验显示，在人胆囊癌细胞系EH-GB1中，si-NC组的穿膜细胞数为（193.7±3.9）个，明显大于 si-CD44 组的（88.7±5.8）个（t=15.12，P＜0.05）；在人胆囊癌细胞系 GBC-SD 中，si-NC组的穿膜细胞数为（193.7±7.8）个，明显大于si-CD44组的（110.3±5.5）个（t=10.42，P＜0.05）；si-CD44 组与si-NC组相比，迁移细胞数目明显减少。

2.4 转染si-CD44后两组细胞侵袭情况 见图4。

由图4可见，Transwell小室细胞侵袭实验显示，在人胆囊癌细胞系EH-GB1中，si-NC组的穿膜细胞数为（175.3±7.5）个，明显大于 si-CD44组的（85.3±3.7）个（t=10.74，P＜0.05）；在人胆囊癌细胞系 GBC-SD 中，si-NC组的穿膜细胞数为（188.0±9.0）个，明显大于si-CD44 组的（73.0±3.6）个（t=11.84，P＜0.05）；si-CD44 组与si-NC组相比，侵袭细胞数目明显减少。

表1 EH-GB1转染si-CD44后两组细胞OD值比较

表2 GBC-SD转染si-CD44后两组细胞OD值比较

图2 CCK8增殖实验的细胞生长曲线

图3 转染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD细胞迁移情况（a:两组细胞结晶紫染色示意图，×200；b：两组穿膜细胞数比较，与si-NC组比较，*P＜0.05）

3 讨论

胆囊癌作为胆道系统最常见的恶性肿瘤，恶性程度较高，易侵犯周围脏器及向淋巴结等器官转移,寻找有效的标志物在胆囊癌疾病诊断和治疗中具有重要意义。CD44是一种膜整合蛋白，是跨膜透明质酸的主要受体，是一种多功能的蛋白，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的接触和结合，参与了很多重要的生物学过程[7]，其阳性表达对多种恶性肿瘤的不良结局起重要作用。Hsu等[8]发现CD44在胰腺癌组织中高表达，并与胰腺癌的不良预后相关，Wood等[9]报道CD44与胰腺癌的侵袭和转移相关。Gao等[10]利用慢病毒介导的siRNA敲低肝细胞系中CD44表达后发现上皮间质转化表型被逆转，从而使癌细胞在体外迁移及侵袭能力减弱，Yang等[11]发现伴CD44高表达的肝细胞肝癌中血管内皮生长因子（VEGF）也同时升高，并且组织中微血管密度（MVD）明显上升，与肿瘤血管生成、复发及转移有关。此外，CD44能够促进结肠癌和乳腺癌的侵袭、迁移，可能是肿瘤细胞内CD44的异常高表达通过增加其与细胞外基质配体透明质酸的亲和力，增强了肿瘤的侵袭性[12-13]。还有研究表明，siRNA介导的CD44下调可显著减弱骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和生存能力,这可能是通过CD44与透明质酸的相互作用增加严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠骨肉瘤肺转移的形成[14]。另有研究认为，CD44可以作为临床早期诊断结直肠癌肝转移的生物学指标[15]。CD44通过与透明质酸结合，对细胞存活、抗凋亡蛋白的活化有一定的影响，从而导致肝癌和肺癌的肿瘤细胞增殖和肿瘤发生[16-17]。此外，CD44的表达也被认为是预测骨肉瘤、卵巢癌和胃癌化疗敏感性的重要生物标志物[14，18-19]。这些结果均表明CD44作为恶性肿瘤生物靶标的可能性。

图4 转染si-CD44后EH-GB1和GBC-SD细胞侵袭情况（a:两组细胞结晶紫染色示意图，×200；b：两组穿膜细胞数比较，与si-NC组比较，*P＜0.05）

人胆囊癌细胞系GBC-SD来源于低分化胆囊癌患者原位瘤组织，能反映原肿瘤细胞特性，而EH-GB1取材于胆囊癌患者的腹壁转移灶，能反映出胆囊癌的高转移活性，因此，同时以它们作为载体，可以较准确的反映胆囊癌的生物学特性。本研究中笔者运用RNA干扰技术在胆囊癌细胞中敲低CD44的表达，Western blot及RT-PCR均显示，EH-GB1和GBC-SD细胞中CD44蛋白表达量均明显降低。通过CCK8增殖实验发现，敲低CD44后对体外胆囊癌细胞EH-GB1和GBC-SD的增殖能力均无明显影响；而迁移和侵袭实验显示，si-NC组24h的穿膜细胞数明显少于si-CD44组，提示沉默CD44基因后，人胆囊癌细胞株EH-GB1和GBC-SD迁移和侵袭能力均明显受到抑制，表明CD44可能通过影响胆囊癌细胞的侵袭迁移能力从而促进胆囊癌的发生、发展，这可能由于CD44作为多功能细胞表面黏附分子，通过对胆囊癌细胞及细胞外基质的结合产生影响，而促进肿瘤细胞的侵袭、转移，但其具体机制仍待进一步研究。我们的实验结果与以往研究结果一致[20]。这些结果表明CD44可能作为胆囊癌治疗的新靶点，通过抑制CD44的表达，可能有效防止胆囊癌的侵袭及转移，为胆囊癌的治疗提供了新的思路。

综上所述，CD44在胆囊癌中表达与人胆囊癌细胞EH-GB1和GBC-SD的侵袭及迁移密切相关，沉默EH-GB1和GBC-SD中CD44的表达，可显著抑制其侵袭、转移活性，这可能会为胆囊癌的治疗提供新的分子靶点，但是CD44调控胆囊癌的侵袭迁移能力的具体机制仍待进一步探索。