仿制低分子肝素的免疫原性研究

王秀萍 ，崔慧斐，陈少鹏

（1.山东大学 药学院，山东 济南 250012；2.东营天东制药有限公司，山东 东营 257067）

依诺肝素钠是低分子肝素类（low molecular weight heparin，LMWH）药物中的代表品种，主要用于预防深静脉血栓形成及其脱落可能导致的肺栓塞。据美国国家心肺血液研究所的数据，美国每年约有10万例肺栓塞病例，肺栓塞的死亡率在住院患者中位居第3。与普通肝素相比，依诺肝素钠和其他LMWH具有更优越的临床性能，包括更长的半衰期、更高的皮下注射生物利用度、更可预测的抗凝作用和更低的出血等副作用，包括肝素引起的血小板减少症（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）的发生率。此外，LMWH一般不需要实验室监测，患者甚至可居家自行注射[1]。2010年，FDA批准了第一个仿制依诺肝素，它代表了美国药品监管科学的一个重大进展，并影响其他几种复杂药物的审评政策。为了获得FDA批准，仿制药申请者必须提交足够的信息，证明仿制药产品与原研药的生物等效性和具有与原研药相同的活性成分、给药途径、剂型及标签等，并具有相同的临床效果与安全性。

在肝素类药物应用中，最致命的潜在不良反应之一即HIT。HIT是由肝素或LMWH与血小板因子4（platelet factor 4，PF4）形成的复合物引发，导致患者不可逆的血小板聚集及减少。在接受LMWH和肝素治疗的患者中，HIT发生率分别为0.2 %～0.4 %和1 %～4 %[2-5]，依诺肝素钠原研药Lovenox临床试验期间发现其HIT的发生率约为1.3 %。后续的研究表明，Lovenox与肝素的HIT发生率分别为0.2 %[6]和2 %～3 %[7]。虽然LMWH的HIT发生率低，但是，其潜在的危害是非常严重的。因为有许多患者居家自行使用LMWH，所以，仿制LMWH制剂的申请者有必要进行相关研究，以评估其安全性，即开展有关HIT相关的免疫原性研究。本文以依诺肝素钠为例，介绍了仿制LMWH的免疫原性研究的内容及方法，以冀为相关产品的开发提供参考。

1 研究概述

针对LMWH类药物使用中引发HIT这一风险，2016年2月FDA发布的“Immunogenicity-Related Considerations for Low Molecular Weight Heparin Guidance for Industry”，该指南[7-8]给出了LMWH药物开展免疫原性研究的建议，包括两部分：

（1）活性成分的一致性研究。包括①理化性质；②肝素来源及降解方式；③二糖组成、寡糖片段与序列；④生物及生化活性；⑤体内药效。这些即所谓的5项标准（five criteria）。

（2）杂质和免疫原性风险研究。包括①LMWH与PF4相互作用；②杂质研究；③利用体外、体内免疫模型开展免疫调节效应研究。

2 研究内容与方法

2.1 活性成分的一致性研究

在美国，仿制药的疗效要求等同于原研药，即therapeutic equivalence。治疗上等效的药物使用时具有相同的临床疗效和安全性，可相互替代，无需调整剂量或进行其他额外监测。疗效的等效性要求仿制药与原研药物具有药物等效性和生物等效性。对于仿制药来说，确立生物等效性比较简单。然而，药物等效性方面面临两个关键挑战：①不同供应商提供的依诺肝素钠必须具有相同的活性。因为依诺肝素钠不像传统小分子药物一样具有简单的化学结构，其是一种复杂的低聚糖混合物。②确保仿制药纯度、质量与原研药的可比性，这样才能确保仿制依诺肝素不会比原研药具有更大的安全性风险（例如免疫原性风险）。

图1 低分子肝素一致性研究示意图[9]

因此，评价仿制依诺肝素与原研药一致性需要科学的方法。2010年7月23日，美国FDA发布编号为FDA-2003-P-0273的对公民请愿的回应[9]中制定了标准的、系统的、严谨的一致性研究项目，见图1。包括：①理化性质；②肝素来源及降解方式；③二糖组成、寡糖片段与序列；④生物及生化活性及⑤体内药效学研究。这5项研究对生产条件的微小变化非常敏感，能识别符合质量标准的LMWH产品差异，区分不同的LMWH产品，甚至可检测到仿制药和原研药的批处理变化。这5项研究的全部信息提供了有力的科学证据，可充分确定仿制药与原研药的活性成分的一致性。

2.1.1 理化性质 理化性质研究是依诺肝素钠结构一致性的重要部分，采用综合分析技术手段进行。依诺肝素钠的特异性是由肝素（依诺肝素钠的原料）的结构特征和用于生产依诺肝素钠的解聚过程，包括肝素的解聚反应类型、反应条件（裂解反应的碱浓度、解聚反应温度和时间），以及分离纯化步骤决定的。分子量与分子量分布是依诺肝素钠特征之一，对依诺肝素钠的活性等影响非常大。开展该指标的研究时，可使用尺寸排阻色谱（size exclusive chromatography）测定依诺肝素钠低聚糖链的分子量与分子量分布，表征其链长的分布及比例。

尺寸排阻色谱通常与被称为糖链作图（chain mapping）[10-11]的方法相结合，在高分辨率下为低聚糖分子的指纹图谱提供互补信息。如使用十六烷基三甲基硫酸氢铵（cetyltrimethylammonium，CTA）动态涂渍C18色谱柱形成强阴离子交换柱（CTA-SAX-HPLC）以增强对负电荷组分的吸附性能。根据依诺肝素钠不同寡糖组分的极性与荷质比不同将寡糖组分有效分离，得到寡糖的高分辨率指纹谱图。另外，使用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）、凝胶渗透色谱-电喷雾电离质谱法（GPC-ESI-MS）、反相离子对-电喷雾电离质谱法（RPIP-ESI-MS）提供高分辨率寡糖指纹图谱。用常规尺寸排阻色谱法与高分辨率指纹图谱法互补以表明仿制依诺肝素与原研药分子量的等同性，有利于确保二者降解方式与程度的一致性。

同时，还应通过分析LMWH的整体化学成分来证明其关键特征的等同性。可使用核磁共振氢谱（1H-NMR）分析依诺肝素钠结构特征，如糖醛酸的差向异构化（艾杜糖醛酸与葡糖醛酸）、非还原端寡糖链糖醛酸的硫酸化比例[12-13]。除此之外，紫外扫描及特定的美国药典（USP）检测项目[如核磁共振碳谱（13C-NMR）、钠含量、硫酸羧基比][14]反映依诺肝素钠寡糖聚合物的多样性。紫外吸收用于表征依诺肝素钠结构中β-消除降解产生的位于非还原端的双键，该双键在232 nm有特征吸收。依诺肝素钠为钠盐，钠含量在一定程度上反映依诺肝素钠寡糖的羧基和硫酸基总量。

理化性质的一致性是建立在综合分析技术的基础上，是证明依诺肝素钠一致性的一个重要组成部分，但仅这一指标的等同性并不能提供足够的信息得出仿制药与原研药含有相同的活性成分的结论。由此，其余的4个项目研究应集中在依诺肝素钠异质性方面。

2.1.2 肝素来源及降解方式 仿制药与原研药的异质性是由起始原料肝素的结构特征和制备依诺肝素钠的解聚过程决定的。

肝素来源于动物组织，当前通常为猪肠黏膜来源。肝素的制备过程包括动物组织中肝素的提取、纯化。肝素是一种线性多糖混合物，由不同化学结构组成。肝素多糖的平均相对分子质量（Mr）为15×103，分子量分布为(5～40)×103[15]。肝素的异质性产生于①糖链的分散性；②二糖的化学多样性；③多糖中相应的二糖序列。肝素的天然组成不同其结构特征就不同[16]，因此，不同动物种属来源的肝素其二糖组成具有显著差异。美国药典（USP）规定制备依诺肝素钠的肝素只能是猪小肠黏膜来源，即使用猪肝素。FDA发布的“Heparin for Drug and Medical Device Use: Monitoring Crude Heparin for Quality”要求对起始物料粗品肝素进行基因检测，使用定量聚合酶链反应（qPCR）检测确保粗品肝素猪来源的唯一性。

依诺肝素钠是猪源肝素解聚形成的化学结构和大小各不相同的低聚糖。由肝素为起始原料制备依诺肝素钠的解聚过程包括两个关键的化学步骤，见图2。首先，从猪肠黏膜中提取的肝素进行酯化，得到相应的肝素苄酯；随后进行碱性β-消除裂解反应[17]。由依诺肝素钠制备过程可知，依诺肝素钠的异质性产生于①糖链的分散性；②低聚糖单元的多样性；③低聚糖链中二糖单元的多样性。

依诺肝素钠解聚过程导致糖醛酸和葡糖胺之间的选择性裂解，使其末端产生一些独特的化学结构，如非还原端的双键和部分还原端的1,6-脱水结构[18]，但不会改变肝素天然二糖序列。因此，依诺肝素钠的结构不仅取决于起始原料肝素的性质，还取决于解聚过程。使用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III联合酶解的方式测定依诺肝素钠中天然与修饰后的二糖组分，反映出仿制依诺肝素与原研药降解方式的一致性，以及二者在天然二糖单元的分布与修饰后的二糖结构方面至少是相似的。

图2 肝素多糖降解成依诺肝素钠过程

2.1.3 二糖组成、寡糖片段与寡糖序列 该项研究用于表明依诺肝素钠一致性的第3个项目即二糖组成、寡糖片段与寡糖序列。这3个部分共同用于表征依诺肝素钠的异质性。

通过进行依诺肝素钠低聚糖链组成部分（二糖单元及其他小的低聚糖链单元）的定性定量分析，评估二糖组成的一致性。通过降解酶（肝素酶I/肝素酶II/肝素酶III）和/或化学手段（如亚硝酸）等方式降解依诺肝素钠得到二糖和/或寡糖如三糖、四糖单元。这些组分可通过多种方法分离和量化，包括毛细管电泳（CE）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）、强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）[19-23]，通过MS、NMR等光谱方法、化学方法或酶法鉴别。这些分析方法可用来定性二糖结构，包括在二糖羟基或氨基上取代的硫酸基与乙酰基结构，还可识别二糖上是否具有葡糖胺、甘露醇胺、1,6-酐环结构或半乳糖醛酸结构。

二糖组成、寡糖谱图和理化性质及肝素来源与降解方式共同提供了充分信息，证明仿制依诺肝素与原研药序列的一致性。因此测定所有寡糖的序列是不必要的。短的寡糖（如四糖、六糖）更容易发生降解反应，因此，对短的寡糖进行测序[24]，能敏感反映工艺条件的变化。

2.1.4 生物及生化活性 该项研究从体外生物生化学方面评价仿制依诺肝素与原研药的一致性。依诺肝素钠的最佳体外生化评估方式是检测其抗FXa和抗FIIa活性[25]。

2.1.5 体内药效学研究 健康受试者在空腹条件下以单剂量、双向交叉试验的形式皮下注射依诺肝素钠注射液进行体内药效学研究，定时采集血样进行抗FXa和抗FIIa活性测定，通过仿制依诺肝素与原研药的活性-时间曲线图、主要药效学参数结果评价仿制依诺肝素与原研药的一致性。

3 杂质和免疫原性风险研究

依诺肝素和其他LMWH均有可能引发HIT。这是一种由免疫反应所导致的严重血栓性疾病，是PF4-LMWH复合物作为抗原物质引发机体产生抗体所致。因此，对仿制依诺肝素的评估应包括可能影响依诺肝素钠免疫原性的因素，并对比研究仿制依诺肝素相对于原研药的免疫原性风险。

LMWH的寡糖结构被认为是引发HIT的重要因素，有人认为LMWH与PF4的关键结合步骤主要是PF4与非特异性寡糖的相互作用所致[26-28]。这些非特异性的相互作用可能依赖于低聚糖的分子量和电荷密度[27-28]，上述研究考虑了分子量的异质性、二糖组成及寡糖序列的一致性，然而，即使活性成分相同，仿制依诺肝素钠与原研药物的免疫原性仍可能不同。具体来说，杂质可能通过直接与依诺肝素钠相互作用、改变与PF4的结合或刺激宿主免疫系统而影响依诺肝素钠的免疫原性。降低与杂质有关的免疫原性风险，可通过以下3个途径开展研究，分别是①LMWH与PF4相互作用；②杂质特征；③体外、体内免疫模型。

3.1 LMWH与PF4相互作用

肝素类药物治疗过程常伴有2种类型的HIT，一种是相对常见的非免疫性HIT（HIT-I型），另一种为罕见的、免疫介导HIT（HIT-II型），其发生机制见图3。

图3 HIT-II的发生机制

研究依诺肝素钠对PF4的亲和性[29]，以及不同比例和浓度下的PF4-LMWH复合物的大小和电荷是必要的[30-33]。几乎所有的HIT患者都能检测到PF4-肝素抗体，HIT在较窄的摩尔比范围内优先识别带正电的PF4与聚阴离子LMWH形成的大分子复合物。PF4在生理条件的离子强度和pH值作用下主要以四聚体的形式存在，并可通过非特异性静电相互作用与LMWH结合。这种对LMWH的亲和力取决于PF4四聚体与多糖的比例。PF4-LMWH复合物的大小对HIT的发病机制至关重要，有研究发现随着PF4-LMWH摩尔比的增加，形成PF4-LMWH复合物的大小随之增加。而在PF4-LMWH复合物形成过程中，其复合物大小、表面电荷及化学计量都有至关重要的作用。

可利用表面等离子共振技术（surface plasmon resonance technology，SPR）研究依诺肝素钠与PF4亲和作用；利用圆二色谱（circular dichroism spectra，CD）研究依诺肝素钠对PF4二级结构的影响。通过PCS光谱（photon correlation spectroscopy，PCS）和Zeta电位（Zp）技术研究复合物大小与表面电荷。其他适用的方法包括尺寸排阻色谱结合紫外光（SEC-UV）分析技术和尺寸排阻色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）分析技术、超速离心、场流分馏和原子力显微镜技术。

3.2 杂质特征

LMWH中的杂质可促进增强产品的免疫原性，起到天然免疫激动剂的作用，它可能会改变LMWH的识别、摄取、处理或呈现，或改变与PF4形成的复合物对免疫系统的影响。杂质对免疫原性的影响取决于它们在最终产品中的性质和水平。因此，需对杂质进行定性和定量表征，证明LMWH不含此类杂质，或含与原研药类似程度和质量的杂质。FDA推荐3种互补的方法，使用多种合适的生物分析方法来研究杂质，包括：①测定依诺肝素钠、肝素原料及其他原料中的杂质（如蛋白质、核酸、脂质）；②评估生产过程去除潜在杂质的能力；③对仿制药与原研药中的杂质进行定性和定量分析。此外，还应提供LMWH货架期的包材可提取和可浸出成分的有关信息。

3.3 体外、体内免疫模型

免疫系统是检测产品杂质和活性成分的微小变化的有效工具。通过适当的体外和/或体内实验，证明仿制依诺肝素和原研药的免疫调节效应，可进一步补充关于免疫原性风险的研究[34-35]。如①ELISA法检测HIT抗体IgG，IgA，IgM；②血小板计数监测：先测基础血小板计数，每日皮下注射依诺肝素钠，期间隔日测1次，用药2周；③功能性测试：依诺肝素钠诱导血小板聚集试验。

综上所述，LMWH免疫原性研究评估了仿制药与原研药在内在结构、活性成分及可能存在的杂质及其所引起的免疫原性风险等，要求仿制药免疫风险不高于原研药，且上市后仍需监测评估该产品。同时要求免疫原性研究用样品需要是不同生产日期的，如刚生产的、中效期、近效期。