GC法测定牛黄上清丸中冰片的含量

庞 静，王学涛，王 健，王 昱，王晓云*

（1.秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066000；2.秦皇岛市药品不良反应监测中心，河北 秦皇岛 066000）

牛黄上清丸为甲类OTC药物，1977至2015年版《中国药典》均有收载，处方来源于明代李梃《医学入门》牛黄上清丸加减方，处方由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连翘、赤芍、当归、地黄、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味药组成，具有清热泻火，散风止痛的功效。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结[1-2]。

方中冰片为传统常用中药，首载于《新修本草》，具有开窍醒神，清热止痛的功效，在方中为佐药[2]。冰片来源较为复杂，成分亦有所不同，为龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品或为樟脑、松节油等用化学方法合成的加工制成品[3]，前者称为天然冰片，后者称为合成冰片。天然冰片的成分几乎为纯粹的右旋龙脑，而合成冰片中同时含有龙脑与异龙脑，是现阶段商品冰片的主要来源[4-5]。牛黄上清丸现执行2015年版《中国药典》（一部）标准，标准中无冰片含量控制项，为保证原药材质量，保证制剂成品质量稳定，有效控制临床疗效，在现有文献报道的基础上[5-9]，本文采用气相色谱法测定牛黄上清丸中龙脑和异龙脑的含量，以其总和计算冰片的含量，同时测定了冰片中樟脑的含量，并对检验结果进行了分析与探讨，为制订完善的质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890A气相色谱仪、FID检测器（美国安捷伦公司），AG-135型十万分之一电子天平(Mettler Toledo)，DL-1028H型超声波清洗器（Bandelin）。

1.2 试药

龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号110881-201107，含量99.3 %）、异龙脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号111512-200802，含量97.5 %）、樟脑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110747-201008，含量：99.0 %）；牛黄上清丸样品（均为大蜜丸）由1～9药厂提供；无水乙醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-FFAP（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；柱温：120 ℃；进样口温度：160 ℃；柱流量：1.0 ml/min；进样方式：分流进样；进样量：1 µl；分流比：10:1；载气：高纯氮气；检测器：FID检测器；检测器温度：200 ℃；氮气：氢气：空气（1:1:10）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取龙脑对照品37.53 mg，置25 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得龙脑对照品储备液。精密称取异龙脑对照品25.37 mg，置25 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得异龙脑对照品储备液。精密称取樟脑对照品10.15 mg，置100 ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得樟脑对照品储备液。分别精密量取5 ml龙脑对照品储备液、5 ml异龙脑对照品储备液和1 ml樟脑对照品储备液，置50 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得149.069 μg/ml龙脑、98.943 μg/ml异龙脑和2.010 μg/ml樟脑的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取牛黄上清丸适量，剪碎，混匀，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25 ml，密塞，称定重量，放置过夜，超声处理（功率1200 W，频率25 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

图1 HPLC色谱图

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按牛黄上清丸处方比例及制备工艺，取冰片以外的18味中药材适量，按照质量标准[1]中[制法]项依法操作，制成大蜜丸，并按2.2.2项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

取2.2项下的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图，见图1。结果表明，供试品溶液的色谱图中，在与混合对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且3种成分与相邻共存成分均可达到基线分离（R≥1.5）；而阴性样品溶液在此保留时间处无干扰。

2.4 线性关系考察

分别精密量取2.2.1项下混合对照品溶液0.5，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 ml，置10 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度系列的对照品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样，测定峰面积。分别以龙脑、异龙脑及樟脑的浓度（μg/ml）为横坐标(X)，以其各自的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程：龙脑Y=25.0049X-1.5701（r=1.0000）；异龙脑Y=24.0310X-1.7772（r=1.0000）；樟脑Y=22.97052X+0.63483（r=0.9991）。结果表明，龙脑、异龙脑、樟脑分别在7.453～149.069 μg/ml、4.947～98.943 μg/ml、0.100～2.010 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取2.2.1项下的混合对照品溶液5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测得龙脑、异龙脑、樟脑峰面积的RSD分别为0.72 %，0.65 %，0.80 %（n=6）。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取2.2.2项下制备的供试品溶液，按2.1项下色谱条件，分别于配制后在室温下放置0，4，12，24，30 h各精密吸取1 μl进样测定，测得龙脑、异龙脑、樟脑峰面积的RSD分别为0.92 %，1.10 %，1.10 %（n=5）。结果表明，供试品溶液在30 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同批号（批号：15015669）的样品6份，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样测定，测得龙脑、异龙脑、樟脑的平均含量分别为2.7380，2.1540，0.01356 mg/g，RSD分别为1.07 %，0.98 %，1.08 %（n=6）。结果表明，方法重复性良好。

表1 加样回收率测定结果

2.8 加样回收率试验

取已知含量（龙脑2.7380 mg/g、异龙脑2.1540 mg/g、樟脑0.01356 mg/g）的牛黄上清丸（批号为15015669）9份，每份约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，制备3个浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3份，分别按供试品含量的50 %，100 %，150 %精密加入按2.2.1项下方法配制的混合对照品溶液（龙脑1.3008 mg/ml、异龙脑1.0023 mg/ml、樟脑6.116 μg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.2.2项下方法自“精密加入无水乙醇25 ml，……”起，制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，测得龙脑、异龙脑、樟脑的平均回收率分别为100.34 %，98.13 %，98.49 %，RSD分别为1.15 %，1.01 %，0.80 %（n=9）。结果表明，本方法回收率较好。

2.9 样品含量测定

取9个厂家样品，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2

表2 牛黄上清丸的含量测定结果

3 讨论

3.1 检测指标的选择

天然冰片中主要含右旋龙脑；合成龙脑中，以樟脑的还原反应得到的合成冰片，异龙脑和樟脑含量均较高；而以松香油中α-蒎烯为原料经酯化、水解得到的合成冰片，含有较多的左旋龙脑和较少的右旋龙脑[10]。由于冰片来源复杂，药物制剂中冰片通常为合成品，在生产过程中有异龙脑生成，用气相色谱分析为龙脑和异龙脑两个峰，又经查阅文献，2015年版《中国药典》（一部）牛黄解毒软胶囊[1]含量测定项下及付萍萍等的《气相色谱法测定醋酸氟轻松冰片乳膏中冰片含量》[8]、林染等的《气相色谱法测定田七痛经胶囊中冰片含量》中均以龙脑与异龙脑总量来计算冰片的含量，本文最终选择以龙脑与异龙脑总量来计算冰片的含量，以控制冰片的质量。另有报道称，樟脑的成分具有一定的毒性，对婴幼儿的影响最为严重[11]，因此同时测定了冰片中樟脑的含量，但没有制定樟脑的限量，可为制定牛黄上清丸中樟脑的限量检查方法提供参考。

3.2 提取时间的选择

在供试品溶液制备试验中分别以超声20 min、30 min、40 min进行提取时间的筛选，经考察龙脑、异龙脑、樟脑的含量无明显差异，最终综合考虑到提取率和操作简便，确定提取时间为30 min。

3.3 检验结果分析及建议

在含量测定中发现，所有检验结果中均存在异龙脑、樟脑，说明所搜集的牛黄上清丸中使用的冰片均为合成冰片；有2个厂家冰片含量较低，可能与原药材的质量差异有关，故对牛黄上清丸中冰片的含量进行测定是非常有必要的。

综上所述，本方法操作简单、结果准确、重复性良好，可用于牛黄上清丸中冰片的质量控制，并可为冰片中樟脑的相关检查及限度制定提供参考。