响应曲面法优化固肾解毒胶囊提取工艺及其对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响研究

赵艺丹，张 蕾，刘 娟，杨智睿，孟祥乐，鄢 丹

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院 临床合理用药生物特征谱学评价北京市重点实验室暨国际合作联合实验室，北京 100038；2.河南大学 药学院，河南 开封 475000；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州450000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是与糖代谢相关的慢性微血管并发症，是导致终末期肾病的重要原因[1]，其发病率高达21.3 %[2]。传统中医药以整体调节、辨证论治的方法治疗糖尿病肾病，具有独特的优势，可有效延缓DN进程[3]。但是目前治疗DN具有良好疗效的中药成方制剂品种仍较少，因此研制开发治疗DN的中药制剂有重要意义[4]。

固肾解毒胶囊（Gushen Jiedu Capsules，GSJD）是根据医疗机构协定处方固肾解毒方研制而成的医院制剂，此方源于南宋洪遵《洪氏集验方》“水陆二仙丹”，由芡实、金樱子、黄连、大黄、黄芪和当归等六味中药组成。方中芡实、金樱子补肾固涩为君，黄连、大黄清热解毒、降浊祛血瘀为臣，佐以黄芪、当归补气养血活血，诸药合用具有补肾降浊、解毒祛瘀之功效，适用于肾阳虚的DN患者[3-4]。多年临床研究表明，固肾解毒方对DN疗效确切，可有效阻止早期DN发展至中晚期[5-6]。而研制GSJD首要及关键步骤是提取工艺，药物具有良好的疗效也与提取工艺的可行性紧密相关。

本研究在单因素实验的基础上，以盐酸小檗碱提取量为指标，采用响应曲面法[7]优化GSJD的提取工艺参数；同时采用糖尿病肾病大鼠模型进一步评价提取工艺可行性，旨在从工艺参数和肾功能两方面综合评价[8-9]，以便获得高提取量和具有良好药效的GSJD提取工艺条件，确定最佳提取工艺参数，为GSJD的后续精制工艺奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；BT125D十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HWS-12型电热恒温水浴锅 (上海一恒科学仪器有限公司)；超声波KQ-600DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；自动生化分析仪Chemray240（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；Nikon Eclipse E200光学显微镜（日本尼康公司）。

1.2 试药及实验动物

盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号110713-201512，供含量测定用）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；其他试剂均为分析纯；芡实、金樱子、黄连、大黄、黄芪、当归（均购于北京金崇光药业有限公司）。

Wistar大鼠，雄性，5～6周龄，150～200 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号：SCXK (京) 2016-0006。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱定量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长345 nm；柱温30 ℃；乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（50:50，v/v）（每100 ml中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0） 为流动相；流速1.0 ml/min；进样量10 μl；理论塔板数按盐酸小檗碱计算应不低于5000。

2.1.2 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含90.9 μg的溶液，即得盐酸小檗碱对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 将芡实、金樱子、黄连、大黄、黄芪、当归药材按（10:10:10:6:10:10）比例加水煎煮，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.16 （60 ℃）浸膏，取浸膏0.2835 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入甲醇-盐酸（100:1，v/v）混合溶液50 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 线性范围考察 精密称定盐酸小檗碱适量，加甲醇溶液使每1 ml含盐酸小檗碱363.60 µg，再以甲醇逐级稀释为每1 ml含盐酸小檗碱分别为181.80，118.17，63.63，45.45，18.18 µg对照品溶液。精密吸取系列对照品溶液各10 μl注入液相色谱仪，记录色谱图并测定峰面积。以峰面积为纵坐标，盐酸小檗碱的浓度 (µg/ml)为横坐标，进行线性回归，回归方程为：Y=22.521X-30.631（r=0.9999）。结果表明，盐酸小檗碱的浓度在18.18～181.80 μg/ml范围内与峰面积之间线性关系良好。

2.1.5 精密度实验 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（90.5 µg/ml）10 μl进样，重复6次，计算对照品色谱峰峰面积相对标准偏差，得盐酸小檗碱峰面积RSD为0.44 %，表明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别于配制后0，2，4，6，8 h进样，记录盐酸小檗碱峰面积，计算相对标准偏差，得盐酸小檗碱峰面积RSD为0.46 %，表明供试品溶液在8 h内基本稳定，可满足含量测定需要。

2.1.7 重复性实验 精密称取同一批样品分别6份，按2.1.3项下供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定盐酸小檗碱含量，计算各含量间的相对标准偏差。结果RSD为0.42 %，表明所建立的定量测定方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率实验 取已知盐酸小檗碱含量样品适量，共6份，分别加入一定质量的盐酸小檗碱对照品，按2.1.3项下供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，得盐酸小檗碱的平均加样回收率为99.5 %，RSD为1.40 %，表明回收率良好。

2.2 单因素考察

将提取液料比、提取时间、提取次数作为影响因素，以盐酸小檗碱的提取量为评价指标。

2.2.1 液料比考察 将各味药材按比例加水煎煮，以固定提取时间为2 h，提取次数为2次，分别考察液料比为6:1，8:1，10:1，12:1，14:1对盐酸小檗碱提取量的影响，结果盐酸小檗碱提取量分别为18.05，20.02，17.31，17.12，16.59 mg/g。结果表明，当液料比为8:1时，盐酸小檗碱提取量最高，因此初步确定8:1为最佳液料比。

2.2.2 提取时间考察 将各味药材按比例加水煎煮，以固定液料比为8:1，提取次数为2次，分别考察提取时间为1，2，3，4 h对盐酸小檗碱提取量的影响，结果盐酸小檗碱提取量分别为16.02，19.56，19.82，20.18 mg/g。结果表明，当提取时间为2 h，盐酸小檗碱提取量相对较高，2 h后提取量未明显增加，因此初步确定2 h为最佳提取时间。

2.2.3 提取次数考察 将各味药材按比例加水煎煮，以固定提取液料比为8:1，提取时间为2 h，分别考察提取次数为1，2，3次对盐酸小檗碱提取量的影响，结果盐酸小檗碱提取量分别为16.60，19.74，19.98 mg/g。结果表明，当提取次数为2次，盐酸小檗碱提取量相对较高，且随提取次数增加盐酸小檗碱的提取量无明显变化，因此初步确定提取2次为最佳提取次数。

表1 Box-Behnken设计与结果

2.3 响应曲面试验结果与分析

2.3.1 响应曲面试验设计、统计及结果分析 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，利用响应曲面设计分析软件Design-Expert 8.0.6进行数据分析，综合单因素实验，选取（A） 液料比、（B）提取时间、（C）提取次数3个因素，以盐酸小檗碱提取量（Y）为响应值，Box-Behnken设计方案与结果见表1。

2.3.2 方差分析 采用ANOVA分析响应面回归参数，得到Y值对A、B、C的二次多元回归模型方程：Y=20.95+0.75A+0.90B+0.50C-0.85AB+0.43AC-0.60BC-2.90A2-2.62B2-1.50C2，R2=0.9817，结果见表2。

由表2可见，选用的模型差异极显著（P＜0.001），表明该2次方程比较显著；失拟项为P＞0.05，表明失拟不显著；该方程R2=0.9817，表明对实验拟合良好，实验误差较小，可用该模型对不同条件下的实验结果进行预测。

表2 方差分析结果

2.3.3 响应面分析 利用Design-Expert 8.06软件对表2的数据进行2次多元回归拟合，通过固定3个变量中的2个为中值，把应变量与另2个因素拟合为三维曲面图，以拟合目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图，所得到的2次回归方程的响应面及其等高线图见图1。确定最佳提取工艺条件为液料比8.24:1、提取时间2.13 h、提取次数2.16次，模型预测Y值为21.09 mg/g。

图1 液料比、时间、次数因素对盐酸小檗碱提取量的三维响应曲面及等高图

2.4 验证试验

为验证该响应曲面法实验的可靠性，用实验中得到的最佳提取工艺条件重复实验。通过响应曲面分析出的最佳提取条件将提取工艺条件确定为液料比8:1、提取时间为2 h、提取次数为2次，修正后的条件进行3次验证试验，Y值分别20.73，21.31，20.61 mg/g，平均Y值为20.88 mg/g，RSD值为1.79 %，实际测得值与理论预测值相对误差约为0.99 %。表明本实验利用响应曲面优化GSJD提取工艺的模型可靠，有良好的预测性，所得的提取工艺参数可靠，具有实际应用价值。

2.5 动物实验设计及结果

2.5.1 动物模型的制备及实验分组 大鼠购入后适应性喂养1周后，进行基础状态血糖及体重的测定，采用随机分组设计，按体重分为正常组和造模组。正常组大鼠给予正常饲料，模型组给予高脂饲料。8周后，正常组大鼠以3 ml/kg的剂量腹腔注射0.1 mmoL/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，造模组则按30 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素溶液（pH 4.2），4周后造模成功的动物随机分为模型组给予蒸馏水10 ml/(kg·d)、福辛普利组（阳性对照组）给药福辛普利钠1.05 mg/(kg·d)、GSJD低、中、高剂量组，分别给药GSJD内容物0.12，0.24，0.48 g/(kg·d)、正常组动物归为正常对照组给予蒸馏水10 ml/(kg·d)，连续灌胃给药8周。

2.5.2 血清尿素氮水平检测 给药8周后，所有动物用10 %水合氯醛4 ml/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，离心后取血清，用全自动血生化分析仪测定尿素氮，所有检测结果以均值±标准误（）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，由统计软件GraphPad Prism version 6.01完成，见图2-a；结果表明，与正常对照组比较，模型组大鼠尿素氮水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，GSJD高剂量组和福辛普利组连续灌胃8周DN大鼠血清尿素氮水平显著降低（P＜0.05）。

图2 GSJD对大鼠尿素氮水平及肾脏病理组织结构的影响

2.5.3 肾脏病理组织学检查 取大鼠肾组织，用4 %多聚甲醛溶液固定，无水乙醇脱水，石蜡包埋，切割制备2～3 mm组织薄片，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），光镜下观察肾组织病理学变化，将各实验组的病理组织学标本置于低倍镜下观察DN大鼠肾脏病理组织结构的影响，结构见图2-b。正常对照组肾脏组织无明显异常；模型组可见肾小球硬化，系膜区扩张，肾小管上皮细胞空泡变性；福辛普利组显示肾小球、肾小管基本恢复正常；GSJD低剂量组仍可见肾小球硬化，肾小管上皮细胞空泡变性，改善作用不明显；GSJD中剂量组肾小球结构基本恢复正常，但仍可见部分肾小管上皮细胞空泡变性；GSJD高剂量组肾小球、肾小管基本正常，与福辛普利治疗效果类似。

3 讨论

GSJD是由临床疗效确切的医疗机构协定处方固肾解毒方研制而成。本研究以盐酸小檗碱的提取量为考察指标，在单因素实验的基础上采用响应曲面法优化GSJD的提取工艺参数，利用Design-Expert 8.0.6软件预测盐酸小檗碱提取量。优化的提取工艺条件简单、快捷，经试验验证，盐酸小檗碱提取量实测结果与预测结果误差为0.99 %，表明该提取工艺稳定、可靠，具有较好的可行性。在确定最佳提取工艺的基础上，采用DN大鼠模型评价本提取工艺的有效性，结果显示采用最佳提取工艺制备的GSJD可显著降低DN大鼠血清尿素氮水平，并对DN大鼠肾脏组织形态学病变有一定的改善效果。

本研究旨在探讨一种优选GSJD提取工艺的模式，得到质量可控性好、有效性易于保证的最佳提取工艺参数。响应曲面法在中药复方提取工艺、中药药对配伍研究、单味药的提取等方面研究较多，且已较为成熟[10-12]。该方法在考察GSJD提取工艺因素实验设计全面，且考察指标经多次验证实验证明结果稳定可靠，含量相对较高，不失为一种考察中药复方提取工艺的有效方法。

虽然以单一成分考察GSJD提取工艺略失偏颇，但本研究结合药效学实验综合评价GSJD的提取工艺，实验结果表明，按该提取工艺制备得到的GSJD具有较好的改善DN大鼠肾功能的作用。此评价方法可为目前中药及复方质量控制的完善提供依据，在检测标准上由传统的“指标性成分”检测向“活性成分关联药效”的模式转变，确保中药制剂的有效性，从而促进中药产业的可持续发展。