EGCG对致龋变异链球菌抑制作用的研究

施秀芳，刘 雨，杨椋昕，王一君，张 晨，王烈成，王元银

龋病是在以细菌为主的多因素作用下牙体硬组织发生的病变。变异链球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)、乳杆菌、放线菌等为常见的致龋菌，其中S.mutans的致龋性主要依赖于其产酸、耐酸及黏附性能。绿茶的主要成分是茶多酚，而茶多酚主要是由儿茶素组成的。儿茶素组分中含量最多的是表儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)[1]。研究[2]证实EGCG在保护神经系统、抗氧化及抑菌等方面起重要作用。该课题组通过观察S.mutans与EGCG在厌氧条件下的共同孵育情况，得出EGCG对S.mutans的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并检测不同浓度的EGCG对S.mutans的光密度(optical density，OD)值、PH值及黏附能力的影响，从而探究绿茶提取物EGCG对致龋S.mutans的抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 材料国际标准变异链球菌菌株ATCC 25175(血清型c)、牛脑心浸出液培养基(brain heart infusion，BHI)购自北京陆桥公司；EGCG购自北京Solarbio公司；蔗糖购自美国Sigma公司；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)，成分为2 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、137 mmol/L NaCl等。

1.2 方法

1.2.1液体二倍稀释法测定MIC值 取8支试管编号1～8，1号试管中加入9 ml 100 mg/L的EGCG药液，2～7号试管中各加入4.5 ml的BHI液体培养基，根据二倍稀释法，1号试管中EGCG的浓度为100 mg/L、2号为50 mg/L、3号为25 mg/L、4号为12.5 mg/L、5号为6.25 mg/L、6号为3.125 mg/L。随后1～7号试管中分别加入0.5 ml的菌液，将7号试管中加入的液体作为阴性对照，空白对照为8号试管中加入的5 ml BHI液体培养基。紫外分光光度计在590 nm波长下测孵育前(0 h)及37 ℃厌氧箱孵育24 h时各试管中S.mutans的OD值，计算24 h该菌的OD增长值，即ΔOD。肉眼观察厌氧孵育24 h时8支试管中该菌的生长情况，以溶液澄清的最小浓度EGCG为EGCG对S.mutans的MIC。

1.2.2不同浓度的EGCG作用下S.mutans的生长变化 依照测定的MIC，1～5号试管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI液体培养基，其中1号试管中EGCG的浓度为2 MIC，其余浓度依次减半。6号及7号试管中分别为4.5 ml、5 ml不含EGCG的BHI液体培养基，1～6号试管中各加入0.5 ml菌液。7支试管均置于37 ℃厌氧箱孵育，孵育前(0 h)及孵育4、8、12、24、48 h时，在590 nm波长下用紫外分光光度计测各试管中S.mutans的OD值，实验重复3次。根据3次实验所测OD值的均值，绘制出不同浓度的EGCG作用下S.mutans的生长曲线。

1.2.3不同浓度的EGCG作用下S.mutans的产酸变化 1～5号试管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI培养基(均含1%蔗糖)，其中1号试管中EGCG的浓度为2 MIC，其余浓度依次减半。6号、7号分别加入4.5 ml和5 ml的不含EGCG的BHI培养基(含1%蔗糖)，1～6号各加入0.5 ml的菌液，7支试管均置于37 ℃厌氧箱孵育。孵育前(0 h)及孵育4、8、12、24、48 h时取样本，离心后收集上清液，pH计检测上清液pH值并记录，实验重复3次。根据3次实验所测pH值的均值，绘制出S.mutans的pH变化曲线。

1.2.4不同浓度的EGCG作用下S.mutans的黏附能力变化 1～4号试管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI培养基(均含1%蔗糖)，其中1号试管中EGCG的浓度为1 MIC，其余浓度依次减半。5号试管中加入4.5 ml不含EGCG的BHI培养基(含1%蔗糖)。1～5号试管中各加入0.5 ml菌液，然后将5支试管倾斜30°置于37 ℃厌氧箱孵育。孵育24 h后取出，试管内液体均倒入第2批相应编号的试管中，原试管中各加入5 ml PBS液，轻轻震荡洗涤，将洗涤液移至第3批相应编号的试管中；原试管中再次各加5 ml PBS液，然后刮下原试管壁上的全部细菌；将第2、3批试管中的溶液进行离心,弃上清液，然后向第2、3批试管中各加5 ml PBS液。充分混匀后在590 nm下测三批试管中S.mutans的OD值，实验重复3次，三批试管对应的均值分别记为A、B、C。通过均值计算不同浓度的EGCG作用下S.mutans的黏附率和黏附抑制率变化，计算公式如下：

黏附率=A/(A+B+C)×100%；黏附抑制率(%) =(对照组黏附率-实验组黏附率)/对照组黏附率×100%。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0软件进行统计分析，多组间均值两两比较采用单因素方差分析的LSD检验，显著水平α=0.05。

2 结果

2.1 EGCG对S.mutans的MIC8号空白对照组溶液为澄清的淡黄色，7号阴性对照组溶液为浑浊的淡黄色，1～5号与8号相似，6号与7号相似。以溶液澄清的最小EGCG浓度为EGCG对S.mutans的MIC，则5号6.25 mg/L的EGCG即为对S.mutans的MIC。计算S.mutans在不同浓度EGCG药液中孵育24 h时的OD增长值，即ΔOD，可见随着浓度的增加，其ΔOD值减少，见表1。为了进一步验证MIC值，采用琼脂稀释法测EGCG对S.mutans的MIC，S.mutans的生长受到80%以上的抑制时，EGCG的最低浓度即为MIC。得出的结论与液体二倍稀释法一致，即6.25 mg/L为EGCG对S.mutans的MIC。

表1 不同浓度EGCG抑制S.mutans的ΔOD值

2.2 EGCG对S.mutans生长的影响EGCG浓度为1/2 MIC时即可在共孵育的各时间段均能抑制S.mutans的生长，差异有统计学意义(4 h：F=17.918，P=0.013；8 h：F=319.461，P<0.01；12 h：F=241.725，P<0.01；24 h：F=2 038.812，P<0.01；48 h：F=3 835.226，P<0.01)，随着药液浓度的增高，对该菌生长的抑制作用逐渐增强。见图1。

图1 不同浓度的EGCG对S.mutans生长曲线的影响

与菌液组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3 EGCG对S.mutans产酸的影响EGCG浓度为1/4 MIC时即可在各时间段抑制S.mutans的产酸能力，差异有统计学意义(4 h：F=120.032，P<0.001；8 h：F=37.020，P=0.004；12 h：F=102.400，P=0.001；24 h：F=317.793，P<0.001；48 h：F=92.571，P=0.001)，随着EGCG药液浓度的增高，对该菌产酸能力的抑制作用逐渐增强。见图2。

图2 不同浓度的EGCG对S.mutans产酸变化的影响

与菌液组比较：**P<0.01

2.4 EGCG对S.mutans黏附能力的影响EGCG浓度为1/4 MIC时与菌液组相比黏附率降低，差异有统计学意义(F=98.195，P=0.001)，且随着EGCG浓度的增加，黏附率逐渐降低，黏附抑制率逐渐增加。见表2。

表2 不同浓度的EGCG对S.mutans黏附的影响

黏附率：各实验组与菌液组比较；抑制率：低浓度组EGCG与相邻高浓度组比较

3 讨论

龋病是人类常见的口腔疾病，是在具有产酸及耐酸性能的乳酸杆菌、S.mutans等作用下分解、破坏牙体硬组织所造成的[3]。细菌致龋的先决条件是菌群以特异性或非特异性的方式黏附于牙面，相互聚集形成菌斑生物膜。S.mutans是世界上公认的主要致龋菌之一，其能够利用生物膜中的多糖提高牙菌斑中酸的含量[4]。研究[5]表明，与低糖或无糖相比，高糖浓度下S.mutans的产酸、耐酸、黏附毒力更强，由此推测，随着糖浓度的提高，S.mutans的致龋能力逐渐增强[6]。

绿茶有着几千年的饮用历史，具有防癌、降血脂、抑菌等多种功效。绿茶的主要化学成分包括茶多酚、蛋白质、糖类、生物碱和氨基酸等[7]。研究[8]证实茶多酚具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌等多种功能。也有研究[9]报道，茶多酚与木糖醇联合应用可明显抑制菌斑的形成。国内研究[10]表明茶多酚对细菌的抑制作用主要表现为对细菌细胞壁的破坏。而国外研究[11]显示茶多酚主要是通过破坏细菌的细胞膜从而抑制细菌的生长、繁殖。茶多酚主要由儿茶素类化合物组成，研究[12]证实儿茶素类化合物能抑制S.mutans的产酸能力。已知EGCG是儿茶素类化合物中含量最高、最具生物活性的成分[13]，具有最强的抗感染潜能以抑制各种微生物的生长及生物膜的形成[14]。但EGCG对致龋S.mutans的抑制作用及具体机制仍待研究。

为探讨EGCG对S.mutans的抑菌效能，本研究利用二倍稀释法检测EGCG对该菌的MIC，将不同浓度的EGCG与该菌共孵育，利用紫外分光光度计测590 nm波长下各浓度EGCG药液中该菌的OD值，pH计测该菌产酸的pH值，并利用OD值评估该菌的黏附性能。该研究结果表明，EGCG对S.mutans的MIC为6.25 mg/L，EGCG浓度为1/2 MIC时即可在共孵育的各时间段抑制该菌的生长，EGCG浓度为1/4 MIC时即可抑制S.mutans的产酸能力且与菌液组相比黏附率降低；随着EGCG浓度的增加，S.mutans的OD值逐渐降低，pH值逐渐上调，黏附率逐渐降低。鉴于EGCG对S.mutans的抑制作用，其可能在龋病的防治领域有重要作用，为龋病的防治提供了新方向。但本研究尚缺乏在体实验的支持，进行在体实验的关键是龋齿模型的建立。该课题组采用4～5周龄的雄性SD大鼠，喂养高糖食物并隔天涂抹S.mutans菌液，以期3～4个月的时间导致龋齿从而建立SD大鼠的龋齿模型。但由于SD大鼠本身不易患龋齿且长期喂养存在不可控性的死亡等，多次造模均未成功。接下来课题组将改进造模方案，争取造出龋齿模型，用在体实验进一步研究EGCG对龋病的影响。