血清25-OH-VD、Hcy和免疫细胞水平与卵巢反应性的研究

郭 楠，吴 莉

卵巢低反应是指在控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)过程中卵巢对促性腺激素(gonadotropins, Gn)反应过低甚至无反应，导致获卵数少、周期取消率高以及临床妊娠率降低。卵巢低反应会在一定程度上危害患者的生殖健康，已经成为辅助生殖技术领域中最具挑战性的难题之一。卵巢低反应受多种因素影响，除了年龄以外，通常认为卵巢反应性的好坏主要取决于卵巢储备情况[1]。而越来越多的临床研究发现，相当一部分年轻、卵巢储备功能良好的妇女也会发生低反应。近年来，部分研究认为卵巢反应与体内的免疫微态有关，而25-羟基维生素D(25-OH-VD)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、免疫细胞亚群(T细胞、B细胞、NK细胞)均是参与机体免疫的重要指标。该研究旨在探讨卵巢反应性与25-OH-VD、Hcy及T细胞、B细胞、NK细胞的关系，为临床上对于卵巢低反应的诊断和治疗提供可靠的参考依据。

1 材料与方法

1.1 基础资料选取2017年9月～2018年2月在安徽省立医院生殖医学中心体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(invitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)治疗的179例患者作为观察对象，根据获卵数目分为2组，其中将获卵数≤3个的61例患者作为卵巢低反应组，将获卵数在4～18个的118例患者作为正常反应组[2]。两组患者的年龄、不孕年限、体质量指数(body mass index,BMI)、窦卵泡数(antral follicle count,AFC)、基础促卵泡生长激素(basic follicle-stimulating hormon,bFSH)、基础黄体生成素(basic luteinizing hormone,bLH)、基础雌二醇(basic estradiol,bE2)等指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者的临床基础资料比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1纳入标准 年龄≤35岁；卵巢储备功能正常；单纯因输卵管因素或男方因素行IVF-ET/ICSI-ET者；本人或家属知情并签署同意书。

1.2.2排除标准 既往多囊卵巢综合征；存在卵巢反应不良高危因素者；合并子宫内膜异位症或其他内分泌疾病；既往不良妊娠史；中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1控制性超促排卵 全部入组研究对象均采用经典黄体期降调节长方案，方法如下：月经周期第2～4天开始口服避孕药(炔雌醇环丙孕酮片，商品名达英-35，拜耳医药保健有限公司广州分公司)1片/次，每天1次，口服用药21 d，在服用第14～17天时采用超声检查有无大卵泡，如无大卵泡，即日开始皮下注射促性腺激素释放激素激动剂醋酸亮丙瑞林微球(批准文号：国药准字H20093852；生产单位：上海丽珠制药有限公司；药品规格：3.75 mg)，根据患者BMI值，调整降调药物剂量1.250～1.875 mg，待14 d后抽血检测促卵泡生长激素(follicle-stimulating hormon,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)同时阴道超声检查卵泡情况，适时加用促性腺激素(批准文号：国药准字H20052130；生产单位：丽珠集团丽珠制药厂；药品规格：以尿促卵泡素效价计75 IU)150～300 IU，当至少有一个卵泡直径达18 mm以上或至少有两个卵泡直径达17 mm时，注射重组人绒促性腺素(注册证号：S20110045；生产单位：Merck Serono Europe Limited；药品规格：250 μg)250 μg。36 h后在超声引导下经阴道穿刺取卵。

1.3.2标本收集 ① 在IVF治疗前一个月经周期第2～5天清晨留取患者空腹静脉血5 ml，用来检测FSH、LH、E2、25-OH-VD、Hcy等指标；② 在GnRHa降调节后14 d，再次空腹来院留取静脉血3 ml，检测FSH、LH、E2等指标；③ 注射重组人绒促性腺素日抽取空腹静脉血3 ml，检测免疫细胞亚群。

1.3.3标本检测 ① 采用免疫化学发光法检测FSH、LH、E2水平，ACCESS全自动微粒子化学发光免疫分析系统购自美国Beckman公司；② 采用ELISA法检测Hcy水平，试剂盒及相关配套检测试剂均购自北京百奥莱博科技有限公司；③ 采用ELISA法检测25-OH-VD水平，试剂盒及相关配套检测试剂均购自美国R&D公司；④ 采用FACSCalibur 流式细胞仪检测T、B、NK细胞亚群，流式细胞仪及相关的配套检测设备均购自美国BD公司。全部数据均取平均值，剔除异常数据。

2 结果

2.1 两组患者的降调结果比较两组患者降调后的FSH、LH、E2、子宫内膜厚度、窦卵泡直径比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2 两组的促排天数、促排用量、Hcy、25-OH-VD表达水平比较卵巢低反应组中Hcy水平均高于正常反应组，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组的促排天数、促排用量、25-OH-VD水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表2 两组患者的降调结果比较

表3 两组患者的Hcy、25-OH-VD水平、促排天数比较

2.3 两组患者免疫细胞亚群表达情况比较卵巢低反应组中T细胞、Th细胞水平均稍高于正常反应组，但差异无统计学意义(P>0.05)，NK细胞比例显著高于正常反应组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两组患者的免疫细胞亚群表达情况比较

3 讨论

3.1 卵巢激素、子宫内膜厚度、窦卵泡直径的检测意义COH是体外受精胚胎移植技术的重要组成部分，该疗法可增加在同一周期的卵泡募集，避免机体内在的选择单个卵泡的机制以及主导卵泡对其他卵泡生长发育的抑制作用，从而使多个卵泡同步生长发育并达到成熟，提高同一周期的获卵数，进而提高妊娠率。由于不同患者的卵巢对Gn的敏感度不同，因此药物的疗效存在一定的差异性。临床上准确预测卵巢反应性，有助于降低周期取消率及减少相关医源性并发症，但卵巢高反应的高低目前尚无统一标准，其中FSH、LH、E2、子宫内膜厚度、窦卵泡直径等指标均是预测卵巢反应性的重要指标，而本研究中两组患者降调后的FSH、LH、E2、子宫内膜厚度、窦卵泡直径比较，差异无统计学意义(P>0.05)，导致上述结果可能与患者的年龄有关，国内学者李丽娟 等[3]的临床研究中证实，年龄超过35岁患者中血FSH、LH等指标对卵巢低反应有较好预测价值，而在年龄低于35岁患者中则无预测价值。

3.2 25-OH-VD、Hcy与卵巢反应性

3.2.125-OH-VD与卵巢反应性 近年来，随着生殖领域研究的不断深入，维生素D在生殖领域中引起了越来越广泛的关注。国外的一项研究指出维生素D可参与钙磷代谢、机体免疫及生殖等生理过程，是生殖过程中的一个关键因素[4]。25-OH-VD是维生素D在机体内的主要循环形态，主要是由维生素D在肝脏中通过羟基化作用转化而来，是目前公认的能够客观评价维生素D营养状况的最佳指标。维生素D参与生殖过程可能与以下几方面因素有关：25-OH-VD可在肾脏中转化为具有活性的1,25(OH)2D3，卵巢是1,25(OH)2D3的靶器官，因此维生素D3活性代谢产物可能在调节卵巢活动中发挥重要作用；另有文献[5]报道，人抗穆勒管激素(AMH)基因启动子区存在一种功能性的维生素D反应素，直接影响AMH的表达，而1,25(OH)2D3可改变颗粒细胞对AMH的敏感性，促进颗粒细胞的分化与发育。这一理论与Irani et al[6]提出的维生素D可以下调AMH基因的表达，上调促卵泡激素受体基因的表达相符。结果提示维生素D水平可能影响着卵泡发育和卵巢的反应性。同时有研究[7]结果表明，白种人维生素D水平和IVF结局呈正相关，然而在亚洲人群中并未观察到这种现象。本结果也显示25-OH-VD水平在卵巢低反应组与正常反应组无显著差异。

3.2.2Hcy与卵巢反应性 Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，近些年国内外一些研究[8]表明，体内Hcy水平升高会对男性和女性的生育力产生一定的影响。本研究结果显示，卵巢低反应组中Hcy水平均高于正常反应组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Hcy可能与卵巢低反应有关。Hcy对卵巢低反应的影响机制目前尚不十分明确，但大量的研究[9-10]显示基因的多态性可能会影响Hcy的表达，而Hcy的高表达可能通过减少细胞分裂、产生相关的炎性细胞因子而导致卵泡发育、胚胎发育、激素分泌等生殖功能受损。

3.3 T细胞、B细胞、NK细胞与卵巢反应性在IVF周期中，为了募集到更多的卵泡而使用大量的外源性Gn，会引起雌二醇及其他激素处于高生理水平状态，免疫微环境也随之改变。一般认为Gn刺激可改变卵泡液中免疫细胞形态及卵泡液和外周血中免疫细胞比例，改变患者机体内的免疫状态。研究[11-12]显示μNK细胞可分泌血管内皮生长因子、趋化因子-10、白细胞介素-8、基质细胞衍生因子-1等多种促血管生成因子，调节血管发生。血管发生的调节在女性生殖生理中扮演着重要的角色，可影响卵泡的生长、优势卵泡及黄体的形成、子宫内膜的分化及胚胎的植入等重要的生理过程，是诱发卵巢低反应的高危因素。Jimmy et al[13]的相关临床研究中显示，在卵巢血流显示欠佳的患者中，至少36%的患者表现出了卵巢低反应，仅有16%的患者表现为正常的卵巢反应。另有研究[14]证实，在反复种植失败的患者中外周血pNK细胞比例增加，pNK呈活化状态，细胞毒性增强。本研究中，两组T细胞与B细胞比例间存在差异但无统计学意义，而NK细胞比例的差异，具有统计学意义(P<0.05)，推测NK细胞或许可通过调控卵巢周围血管的生成及改变卵巢周围的免疫微环境，通过产生细胞毒性来影响卵巢反应，造成卵巢反应不良。

综上所述，Hcy、NK细胞与卵巢反应性存在密切的相关性，二者的高表达或可引起卵巢低反应，进而影响生殖健康。当然本研究也存在一定的局限性，由于研究时间有限，加上卵巢低反应组内患者的病例数较少，因此试验结果可能存在一定偏差，今后逐步完善试验方案，扩大试验规模，进一步探讨血清25-OH-VD、Hcy和免疫细胞水平与卵巢反应性的相关性，为临床治疗提供参考依据。