人脐带沃顿胶薄片对大鼠面神经损伤后髓鞘的修复作用

李 牧，李东朋，宋 迪，赵成斌，岳赛超，冯 杰，杨 波，关方霞

1)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052 2)北京回龙观医院精神科 北京 102200

面神经为周围神经重要的一支，由于其结构和位置的特殊性，在外伤、手术、炎症或肿瘤等情况下较易受到损伤，可引起部分或完全性面瘫，严重影响面部美观、功能及生活质量[1]。面神经损伤的药物及手术治疗效果欠佳，神经功能恢复难以达到损伤前的水平，因此寻找有效的治疗方法尤为重要。沃顿胶富含具有多向分化及神经修复潜能的细胞，具有改善损伤局部微环境和神经修复的作用[2]。本研究采用人脐带沃顿胶薄片治疗面神经损伤模型大鼠，观察髓鞘修复效果及电生理变化，测定损伤局部髓鞘蛋白及细胞因子的表达分布，探讨可能的分子机制，为人脐带沃顿胶薄片修复面神经损伤奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器选用健康成年雌性Wistar大鼠64只，体重180～210 g，购自河南省实验动物中心[动物合格证号：SCXK(豫)2010-0002]。饲养条件符合清洁级标准，环境温度控制在22～24 ℃。HE染色试剂盒购于北京博奥森公司，髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、 脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)购于武汉博士德公司，ELISA试剂盒购自美国TSZ Biosciences公司。肌电图诱发电位记录仪[Keypoint 4(33A04)，Denmark公司]，电镜(SMZ1000，尼康公司)。

1.2沃顿胶薄片制作人脐带由郑州大学第一附属医院产科提供,捐赠者均签署知情同意书，经检测传染性相关指标均呈阴性后用于本实验。剥离脐带外膜并分离去除动静脉后即为沃顿胶组织，剪成 5 mm3大小组织块，置于培养皿中，加入5 mL无血清DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。当在显微镜下观察到培养皿中组织块有间充质细胞长出时，说明沃顿胶组织已有活性。取出沃顿胶组织块，采用细胞切片机将组织块制成5 mm2大小，厚度50 μm的薄片备用。

1.3实验分组及模型制作实验前仔细观察大鼠面部，评估面神经功能，确认触须活动无异常、面部对称、瞬目反射无异常。采用随机数字表法将64只大鼠分为3组，假手术组(n=14)，模型组(n=25)，沃顿胶薄片组(n=25)。所有大鼠用盐酸氯胺酮(0.2 mL/kg)腹腔内注射麻醉并维持体温，固定头颅，耳前后常规剃毛备皮消毒，于大鼠耳后横行切口，逐层切开皮肤，暴露颞肌表面面神经，沿面神经分支逐步寻至面神经茎乳孔出口，剥离茎乳孔后方附着于颅骨上的颞肌，暴露茎乳孔后方颅骨，以磨钻缓慢仔细磨开颅骨，直径约 5 mm，暴露面神经颅内段主干。假手术组只暴露面神经主干，模型组以无损伤血管钳钳夹20 s，沃顿胶薄片组先钳夹20 s，再将沃顿胶组织块贴敷于损伤的神经处，依次缝合肌肉和皮肤。模型制作中无大鼠死亡。

1.4大鼠面神经功能评估分别在造模后第 1、3、10、20、30天测试瞬目反射、触须活动，观察鼻尖位置，并进行评分。①瞬目反射中双侧眼睑闭合无明显差异为0分，患侧眼睑闭合反应较对侧延迟为1分，患侧眼睑无法闭合为2分。②双侧触须活动灵敏、对称、无明显差异为0分，患侧触须活动较对侧明显减弱但仍有触须活动为1分，患侧触须活动完全消失为2分。③鼻尖位置居中为0分，鼻尖歪斜、偏向对侧为1 分[3]。

1.5电生理检查造模后第30天，采用肌电图诱发电位记录仪，在电磁屏蔽室内进行电生理检测(双侧同时检测)。大鼠腹腔内注射盐酸氯胺酮(0.2 mL/kg)麻醉，取俯卧位，固定头部及四肢。刺激电极和记录电极均采用同心圆针型双极电极。刺激电极置入面神经出茎乳孔处皮下，记录电极置于记录侧触须垫肌肉中，接地电极置于鼠尾。采用波宽为0.2 ms，频率为1 Hz的方波脉冲电流，连续同强度刺激诱发复合肌肉动作电位，测量并记录M 波潜伏期和波幅。每只大鼠测试2次，间隔10 min，取2次测试的平均值。测试完成后处死大鼠，取钳夹损伤段面神经主干，用于以下检测。

1.6面神经组织病理学观察取面神经主干，置于体积分数10%的甲醛溶液中固定3 d，作冠状位石蜡切片，片厚4 μm，HE染色，常规脱水，中性树胶封片。光镜(×200)下观察。

1.7透射电镜观察超微结构取面神经主干，PBS冲洗后，切成小组织块，迅速加入体积分数为2.5%戊二醛固定液，4 ℃避光保存。48 h后加体积分数1%锇酸1.5 h，PBS洗3遍，梯度丙酮脱水，吸干液体，树脂包埋。37 ℃烤箱过夜，切片、染色，透射电镜(×4 200)下观察。

1.8Western blot法测定面神经MBP、BDNF、 NGF蛋白的表达取面神经主干，加液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低温离心15 min，吸取上清用BCA法进行蛋白定量。灌制分离胶、积层胶。上样电泳，恒压80 V、40 min，切下目的蛋白和内参，半干转膜，恒流95 mA，60 min，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。脱脂奶粉封闭1 h。加一抗孵育，稀释浓度比例：MBP(1∶50)，BDNF(1∶100)，NGF(1∶100)和β-actin(1∶200)。用TBST洗脱3次，每次5 min。用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TBST 洗膜3次，ECL化学发光显影成像，用Im-age J 图像分析软件进行条带灰度分析。以目的蛋白和内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.9ELISA检测面神经炎症因子的分泌取面神经主干，用液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低温离心15 min，收集上清冻存。按照试剂盒说明测定IL-1β、 IL-10、TNF-α、NF-κB含量。

1.10统计学处理采用SPSS 22.0分析数据。采用重复测量数据的方差分析比较3组大鼠造模后不同时间点面神经功能评分的差异，采用单因素方差分析比较3组大鼠其他指标的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1术后一般情况及面神经功能评分3组大鼠实验及观察期间存活良好，切口无感染，无并发症出现。假手术组大鼠瞬目反射灵敏，未出现触须运动减弱，鼻尖位置居中。造模后第1、3、10、20、30天，模型组面神经功能评分均较假手术组升高，第20、30天，沃顿胶薄片组面神经功能评分较模型组降低，见表1。

表1 造模后不同时间点各组大鼠面神经功能评分

F组间=12.810，P<0.001；F时间=19.370，P<0.001；F交互=1.869，P=0.280；*：与假手术组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

2.2神经电生理测定结果术后第30天，模型组M波潜伏期升高，神经电位波幅降低，沃顿胶薄片组均较模型组改善，见表2。

表2 造模后第30天各组大鼠面神经电生理检测结果

*：与假手术组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

2.3损伤段面神经病理学和超微结构改变损伤段面神经病理学改变：假手术组面神经主干纤维呈长条形，平行排列，细胞排列整齐，神经纤维束被束膜包裹，结构完整。模型组可见神经纤维连续性中断，大量炎性细胞增生，轴突连续性消失，施万细胞肿胀，分布散乱，出现脱髓鞘改变。沃顿胶薄片组神经损伤明显减轻，可见再生的髓鞘，细胞分布欠均匀，再生毛细血管及胶质细胞增多，炎性细胞浸润减少。超微结构改变：假手术组神经纤维髓鞘结构完整、板层结构清晰，无变性脱髓鞘情况，细胞器丰富。模型组电镜下可见神经纤维肿胀，呈现脱髓鞘改变，髓鞘结构松散，呈空泡状改变，并有沃勒变性后脱落的髓鞘。沃顿胶薄片组表现为髓鞘明显增厚,但厚薄仍不均，髓鞘板层结构略松散，有少量空泡状改变。见图1。

A:病理学改变；B：超微结构；1～3：分别为假手术组、模型组、沃顿胶薄片组

2.4损伤段面神经主干MBP、BDNF及NGF蛋白的表达与假手术组相比，模型组损伤段面神经主干MBP、BDNF的表达减少，NGF的表达增多；与模型组相比，沃顿胶薄片组MBP、BDNF及NGF的表达增多，见图2、表3。

2.5损伤段面神经炎症因子分泌水平的比较模型组损伤段面神经IL-1β、IL-10、TNF-α、NF-κB的分泌高于假手术组，而沃顿胶薄片组IL-1β、IL-10、NF-κB的分泌降低，见表4。

1～3：分别为假手术组、模型组、沃顿胶薄片组

表3 3组大鼠损伤段面神经主干MBP、BDNF及NGF蛋白表达的比较

*：与假手术组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

表4 3组大鼠损伤段面神经炎症因子水平的比较 mg/L

*：与假手术组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05

3 讨论

面神经损伤后常表现为周围性面瘫，如额纹消失、鼻唇沟变浅、口角歪斜、鼓腮漏气等[4-5]，给患者带了诸多不便。目前临床上的治疗方法主要有药物治疗、物理治疗等[6]，但面神经损伤后的修复仍然是个棘手的问题。人脐带沃顿胶是指脐带去除外膜、动静脉后剩余的胶冻样组织，其中富含大量的间充质干细胞，具有分化能力强、免疫源性低等特点[7]，有实验[8-9]证实其具有神经修复作用。

本实验结果显示通过面神经挤压建立面神经损伤模型后模型大鼠面神经功能评分较假手术组升高，说明造模成功。面神经功能评估、神经电生理检测及组织病理学和超微结构观察显示面神经损伤后发生脱髓鞘、髓鞘形成障碍及髓鞘形成延迟等病理改变。髓鞘结构由施万细胞、轴突和基膜相互作用而形成，整个发育过程受到严格调控，任何环节的异常均可能导致髓鞘形成障碍或髓鞘结构异常，可导致相应的周围神经病变。髓鞘还能为长距离神经冲动跳跃式传导提供结构基础，对神经有营养支持作用，可发挥促进损伤修复等作用[10]。本研究结果显示，沃顿胶能够改善面神经功能，促进髓鞘完整性的恢复。

MBP是髓鞘的主要结构蛋白，在中枢神经系统和周围神经系统中均有表达，分别由少突胶质细胞和施万细胞合成和分泌，占周围髓鞘相关蛋白总量的15%～20%[11]。MBP对髓鞘保持紧密性具有重要的作用，可维持髓鞘结构和功能的稳定，同时对于髓鞘形成具有启动作用[12]。本实验显示沃顿胶能够促进MBP的表达，对髓鞘起到修复作用。沃顿胶纤维结构之间有空隙存在，有利于营养物质供给和代谢废物的排泄，有助于细胞增殖和细胞分泌外基质，此外其亦可分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、软骨细胞等[13-14]。我们推测沃顿胶这种结构可为髓鞘细胞提供细胞支架材料，有利于髓鞘的修复。此外，薄片修复可避免局部大的瘢痕及细胞分布不均。

沃顿胶通过对局部微环境的影响促进神经修复，是因为它可为这种生物修复过程提供各种细胞因子和生长因子[15]。研究[16]表明沃顿胶能够促进NGF的分泌，抑制炎症介质的释放。本实验结果显示沃顿胶薄片组BDNF、NGF的表达高于模型组，而IL-10、IL-1β、NF-κB的分泌低于模型组，提示沃顿胶治疗能够增加神经营养因子BDNF、NGF的分泌，促进神经元的再生和分化，同时减轻面神经损伤后的炎症反应，从而参与神经损伤的修复。

总之，沃顿胶薄片可促进大鼠面神经损伤后的髓鞘修复，改善大鼠面神经损伤后行为学及电生理情况，其机制可能与沃顿胶薄片上MBP的表达促进神经营养因子BDNF、NGF的分泌，减少炎症因子IL-1β、IL-10、NF-κB的释放，改善损伤区域局部微环境有关。