沉默Msi1对食管鳞癌TE7细胞CCL2分泌及单核细胞趋化的影响

王金金，秦国慧，杨 黎，张 毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫与生物治疗重点实验室 郑州 450052

食管癌的发病率居世界恶性肿瘤第8位，并是全球癌症相关死亡的第6大原因[1]。食管鳞状细胞癌是亚洲最常见的食管癌组织学类型，尤其在河南等地高发[2]。目前食管癌的常规治疗手段包括手术、放化疗等，但5 a生存率不足20%，且复发率较高[3]，这就需要寻找一种新的治疗方法以改善食管癌患者的预后。Msi1是一种RNA结合蛋白，能特异性地识别靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)，从而影响靶基因的翻译。既往研究[4-9]发现Msi1可以通过影响细胞增殖、侵袭、上皮间质转化等促进多种肿瘤的恶性转化。本课题组的前期研究[10]结果显示Msi1可以增强食管癌细胞的增殖、迁移及干细胞成球能力，但并未进一步探讨其对肿瘤微环境的影响。CCL2是趋化因子CC亚家族的一员，即单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，可以趋化单核细胞，影响其吞噬作用以及产生抗体。研究[11]表明血液中的单核细胞可在M-CSF、IL-4等细胞因子诱导下转化为肿瘤相关的巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM)，从而抑制肿瘤生长。本研究通过沉默食管鳞癌TE7细胞Msi1基因的表达，探究其对趋化因子分泌及免疫抑制细胞定向运动的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂食管癌TE7细胞系购自中国科学院上海细胞库(TE7细胞系传第5代，在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640、37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞恒温培养箱中培养)，RPMI 1640培养基、CBA定量试剂盒(捕获微珠、Assay、Buffer、检测抗体)、靶向Msi1的siRNA(siMsi1)及对照siNC均购自郑州莱宝实验器材有限公司，Lipofectamine 3000、Opti培养基均购自美国Invitrogen公司，Trizol、qRT-PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix购自德国Roche公司，人CCL2或MCP1 ELISA试剂盒、人趋化因子检测试剂盒购自BioLegend公司，CD14细胞免疫磁珠分选器材(CD14免疫磁珠、磁分选缓冲液、磁分选柱)购自德国美天旎公司。

1.2细胞分组及siRNA转染将处于对数生长期的TE7细胞以1×105个/mL的密度接种于12孔板内，分为对照组(siNC组)、siMsi1#1、siMsi1#2组(序列见表1)，每组设3个复孔。转染当天，弃去上清液，并用无血清RPMI 1640洗2次，取3 μL lipo fectamin 3000 加50 μL Opti-DMEM培养基稀释，轻轻混匀。将配置好的Lipofectamine 3000和siRNA充分混匀，室温放置10 min后加入到含有细胞和培养基的培养孔中，轻柔摇晃培养板，培养48 h。

表1 siMsi1序列

1.33组TE7细胞中Msi1mRNA表达的qRT-PCR检测用Trizol提取3组TE7细胞的总RNA，确定无降解后，取3 μg反转录合成cDNA，用cDNA为模板进行PCR，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA的相对表达量[12]。

1.43组TE7细胞培养上清液中趋化因子表达的检测收取转染48 h后3组细胞的上清液，在检测前离心。首先取冻干标准品梯度稀释制备成1∶1、1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶625的标准品；随后将13种已经预混的细胞因子捕获微珠充分涡旋混匀，200×g离心5 min，室温避光孵育30 min；每管加入25 μL混合好的捕获微珠、25 μL标准品或待测样品、 25 μL Assay Buffer、25 μL抗体，混均，室温避光孵育3 h；洗涤重悬后上流式细胞仪检测，应用BD FACSDiva软件进行计数，检测3组细胞上清液中IL-8、CXCL1、CCL11、CCL17、CCL2、CCL5、CCL3、CXCL9、CXCL5、CCL20、CXCL10、CXCL11、CCL4的表达。

1.5siNC、siMsi1#1组TE7细胞培养上清液中CCL2表达的ELISA法检测收集培养48 h后的细胞培养上清液100 μL。首先ELISA板中每孔加入100 μL 1×捕获抗体4 ℃包被过夜(>16 h)，洗板4次；在ELISA板中加入100 μL的标准品或样品，室温2 h，洗板4次；加入1×检测抗体，室温1 h，洗板4次；加入100 μL 1×辣根过氧化物酶，室温30 min，洗板5次；加入100 μL显色液，室温、避光10～15 min；每孔加入1 mol/L H2SO4后，用酶标仪读数，绘制标准曲线，计算样品上清液中CCL2的质量浓度。

1.6siNC、siMsi1#1组TE7细胞培养上清液对单核细胞趋化的影响收集10 mL健康人外周血，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，用磁分选缓冲液重悬PBMCs，显微镜下计数后，离心弃上清，每1×107个细胞避光加入80 μL磁分选缓冲液和20 μL人CD14磁珠，混匀后4 ℃孵育20 min。再加入适量磁分选缓冲液离心清洗细胞，再次加入磁分选缓冲液重悬。将磁分选柱固定于磁场中，用磁分选缓冲液润洗一次，然后缓慢加入细胞悬液，待柱内液体滴尽后，再用缓冲液清洗柱2次。取下柱子后，用活塞快速加压将细胞收集至离心管内，离心弃上清，沉淀即为CD14+T细胞。取1×105个CD14+T细胞重悬在200 μL无血清培养基中，将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室分别加入600 μL siNC、siMsi1#1组的细胞培养上清液。2 h后于倒置荧光显微镜下拍照计数，每孔在高倍镜(×200)下取5个视野计数细胞总数。实验重复3次。

1.7统计学处理使用GraphPad 7进行数据分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组TE7细胞中Msi1 mRNA表达的差异，应用两独立样本t检验比较siNC、siMsi1#1组趋化因子CCL2的表达量、单核细胞迁移数量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.13组TE7细胞中Msi1mRNA的表达与siNC组(1.11±0.13)相比，siMsi1#1组(0.16±0.04)和siMsi1#2组(0.24±0.05)Msi1 mRNA的表达均降低(F=48.030,P<0.001)，且siMsi1#1组的沉默效率高于siMsi1#2组(P<0.05)。

2.23组TE7肿瘤细胞上清液中13种细胞因子的表达见图1。由图1可知，相对于siNC组，siMsi1#1与siMsi1#2组只有CCL2表达量降低，其余12个细胞因子的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。根据Msi1的沉默效率及13种细胞因子的分泌量，选用沉默效率较高的siMsi1#1进行后续实验。

2.32组TE7细胞培养上清液中CCL2的表达ELISA检测结果显示，siNC组CCL2蛋白的表达量为(282.20±14.05) ng/L，siMsi1#1组为(209.70±15.58) ng/L，siMsi1#1组低于siNC组(t=3.475，P=0.003)。

2.42组TE7细胞培养上清液对单核细胞趋化作用的比较见图2。由图2可知，siNC组迁移单核细胞数为(202.0±31.8)个，siMsi1#1组为(938.7±63.4)个，差异有统计学意义(t=15.230，P=0.001)。

图1 3组细胞培养上清液中13种细胞因子的表达

A：siNC组；B：siMsi1#1组

3 讨论

本课题组的前期研究[10]结果表明，Msi1基因可以促进食管癌细胞的干性，促进肿瘤的发展；本研究进一步观察了Msi1对肿瘤微环境的影响，发现用siRNA沉默TE7细胞Msi1的表达后，细胞CCL2蛋白的分泌降低，对单核细胞的趋化减弱。

有研究[13-14]表明CCL2可以趋化TAM到肿瘤部位，而肿瘤部位的TAM可以通过分泌转化生长因子-β(TGF-β)等细胞因子抑制T细胞的功能[15-16]，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫监视，促进肿瘤的生长。本研究结果表明，Msi1可能通过调控食管癌TE7 CCL2蛋白的表达，调控单核细胞的趋化，从而促进肿瘤的进展。

本研究还发现siMsi1可以减少CCL2的分泌，但细胞培养上清液中仍可以检测出CCL2蛋白，提示可能还有其他作用参与CCL2分泌的调控。目前CCL2抑制剂Carlumab已经完成了二期临床试验，虽然作为单药不能长期抑制CCL2蛋白的分泌，但仍显示出了短期的CCL2分泌抑制作用及抗肿瘤功能，并在小鼠的实体肿瘤模型中显示出一定的疗效[17]。因此同时靶向Msi1及CCL2蛋白可能产生有效的抗肿瘤效果，这有待于进一步的研究。

综上所述，Msi1可能通过CCL2趋化单核细胞，影响肿瘤进展；靶向Msi1及CCL2蛋白可能会有良好的抗肿瘤作用，这为食管癌的治疗提供了一定的实验基础。