不同亚群CD8+T细胞表型、功能分子及分化相关基因的表达

田永贵，张 震，尹 婕，申春一，张 毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)河南省肿瘤免疫与生物治疗重点实验室 郑州 450052 3)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 4)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052

恶性肿瘤严重威胁人类生命健康，虽然传统治疗方法取得了一定的疗效，但仍存在局限性，患者预后仍较差。以过继性细胞免疫治疗为代表的免疫疗法为肿瘤患者带来了新的希望。过继性细胞免疫治疗是将患者体内的免疫活性细胞经体外扩增和功能鉴定后，回输给患者，其重要特征是免疫记忆性，但是输注的T细胞大部分处于终末分化状态，在肿瘤微环境中易凋亡且抗肿瘤效应差，影响疗效[1]。CD8+T细胞是机体抗肿瘤的主要效应细胞，活化的CD8+T细胞可释放颗粒酶、穿孔素、TNF-α、IFN-γ等细胞因子。CD8+T细胞分为初始T细胞(Tn)、中心记忆性T细胞(Tcm)、效应记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Teff)[2-3]。记忆性T细胞(Tcm和Tem)是具有自我更新能力的多能细胞，可维持机体免疫记忆功能，并参与再次免疫应答[4-5]。其中Tcm是长寿的记忆性T细胞，有很强的增殖潜力和细胞因子生成能力，抗肿瘤能力优于Tem 细胞[6-7]。T细胞在体外培养过程中，随着激活性标志物(如CD69、CD28)的表达上调，耗竭性标志物PD-1的表达也会上调，并影响T细胞的分化和功能[8]。如何在体外获得大量记忆性T细胞是目前研究的热点。该研究通过检测不同亚群CD8+T细胞分化相关基因的表达，确定记忆性T细胞分化相关基因的表达谱，为体外诱导记忆性T细胞的形成提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料及试剂无菌条件下采集健康受试者外周血，4 ℃保存(不超过6 h)，外周血的采集获得本人知情同意。人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，细胞免疫磁珠分选材料(CD8 免疫磁珠、MACS 缓冲液和LS柱)均购自德国Miltenyi Biotec公司，RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司，Trizol和SYBR Green染料购自TaKaRa公司，CD3、CD8、CD45RA、CCR7、CD69、CD28、PD-1、IFN-γ和IL-2流式抗体购自BD公司。

1.2外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分离将10 mL健康受试者外周血转移至50 mL离心管中，加入PBS至35 mL。另取一个50 mL离心管，加入15 mL淋巴细胞分离液，将稀释的血液缓慢倒入该离心管中，2 500 r/min离心25 min。无菌吸管吸取淋巴细胞白膜层至另一个无菌离心管中，加入适量PBS，1 500 r/min离心10 min，弃上清便可得PBMCs。

1.3CD8+T细胞的分选及培养在PBMCs中加入适量4 ℃MACS 缓冲液，1 500 r/min离心10 min，弃上清；加入适量4 ℃缓冲液重悬细胞，并加入适量CD8免疫磁珠混匀，4 ℃避光孵育15～20 min，期间混匀2次；加入3 mL 4 ℃缓冲液，1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入 500 μL 4 ℃缓冲液重悬细胞；将LS柱固定在磁场中，加入缓冲液润洗1次，然后缓慢加入细胞悬液，待柱内无液体后，再使用适量缓冲液润洗柱子3次。加入5 mL缓冲液后，将柱子移出磁场，然后迅速使用活塞将细胞压出至新离心管中，得到的细胞为CD8+T细胞。分离的CD8+T细胞用含体积分数10%胎牛血清和青/链霉素双抗的RPMI 1640培养。

1.4CD8+T细胞亚群的分选在CD8+T细胞中加入CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC流式抗体，4 ℃避光孵育15 min，利用流式分选仪(BD FACSAria Ⅱ)分选CD8+T细胞亚群Tn(CD45RA+CCR7+)、Tcm(CD45RA-CCR7+)、Tem(CD45RA-CCR7-)和Teff(CD45RA+CCR7-)。记录各亚群的比例。

1.5CD8+T细胞亚群表型及功能分子的检测取1×106个CD8+T细胞，加入适量表面抗体(CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-APC、CD69-FITC、 CD28-PE、PD-1-FITC)，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入 200 μL PBS，上流式细胞仪(BD FACS-Canto Ⅱ)检测CD8+T细胞的亚群和表型。

将CD8+T细胞铺于24孔板中，分别加入PMA(50 mg/L)、离子霉素(750 mg/L)、阻断剂(BFA)，刺激6 h后收集细胞于1.5 mL离心管中，用PBS清洗2遍，加入适量表面抗体CD3-PE-Cy7、CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CCR7-FITC，4 ℃避光孵育15 min；加入400 μL固定剂，4 ℃避光孵育30 min；加入400 μL破膜剂，4 ℃避光孵育1 h；加入适量功能分子抗体IFN-γ-FITC、IL-2-PE，4 ℃避光孵育15 min；加入1 mL PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入 200 μL PBS，上流式细胞仪(BD FACS-CantoⅡ)检测CD8+T细胞功能分子的表达。

1.6CD8+T细胞分化相关基因的富集分析采用基因注释分析工具Metascape进行分析。打开Metascape的主页(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，提交分化相关基因列表，选择物种H.sapiens，点击Express Analysis进行分析，生成富集通路柱状图。

1.7CD8+T细胞亚群中转录因子、凋亡、干性等相关基因表达的qRT-PCR检测将分选的CD8+T细胞亚群离心，获取沉淀，每管加入1 mL Trizol重悬，提取RNA，并用TaKaRa反转录试剂盒反转录获取cDNA；以2 μL cDNA为模板，加入10 μL SYBR Green染料、8 μL 1 μmol/L的上下游引物(引物及序列见表1)混合物。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个循环；72 ℃ 10 min延伸。结果以2-ΔΔCt表示。采用GraphPad Prism 7对qRT-PCR结果进行分析并生成热图。

续表1

1.8统计学处理采用SPSS 17.0对数据进行分析。采用单因素方差分析和LSD-t检验比较CD8+T细胞不同亚群间表型、功能分子及其分化相关基因表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CD8+T细胞亚群的比例4个亚群的比例分别为Tn(43.07±16.09)%，Tcm(9.08±3.67)%，Tem(23.59±11.20)%，Teff(24.27±16.08)%。

2.2CD8+T细胞亚群的表型分析结果见表2。Tcm中CD69和CD28表达高于Tem和Teff(P<0.001)，而PD-1表达则低于Tem和Teff(P<0.05)。

表2 CD8+T细胞亚群表型分子的表达 %

*：与Tcm组相比，P<0.05

2.3CD8+T细胞亚群的功能分析结果见表3。与Tem和Teff相比，Tcm中IFN-γ、IL-2的表达水平明显增高(P<0.05)。

表3 CD8+T细胞亚群的功能分子的表达 %

*：与Tcm组相比，P<0.05

2.4CD8+T细胞分化相关基因的富集分析见图1。CD8+T细胞分化相关基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。

图1CD8+T细胞相关基因的富集通路柱状图

2.5CD8+T细胞亚群中相关基因mRNA的表达结果见图2。与Tem和Teff相比，Tcm中趋化因子受体(CCR7、CXCR4)、STAT3通路相关基因(IL-21、STAT3)、自我更新的干性基因(C-myc、Lin28)、抗凋亡基因(Bcl-2)的表达水平增高(P<0.05)，见表4、5。

图2 CD8+T细胞亚群中分化相关基因的表达热图

*：与Tcm组相比，P<0.05

表5 CD8+T细胞各亚群中自我更新及抗凋亡相关基因的表达

*：与Tcm组相比，P<0.05

3 讨论

记忆性T细胞在维持机体免疫记忆及抗肿瘤效应中发挥重要作用。CD8+T细胞各亚群具有不同的基因表达谱和抗肿瘤能力。Tcm高表达与记忆相关的基因，具有自我更新能力以及向肿瘤部位趋化的能力。Tem高表达效应相关的基因，但是增殖能力和自我更新能力较Tcm差。Tcm抗肿瘤能力优于Tem，将Tcm应用到肿瘤免疫治疗中，可提高患者的治疗效果。记忆性T细胞的分化受到多种因素的调控，如转录因子、代谢检查点、免疫检查点和信号通路分子等[9]。鉴定不同T细胞亚群的差异基因表达，寻找与记忆性T细胞分化相关的基因，可为体外诱导培养记忆性T细胞提供新策略。

CD8+T细胞表达的共刺激分子(如CD69和CD28)与其对应的配体结合，引起CD8+T细胞的活化[10]；CD69活化刺激IL-2和IFN-γ的分泌，进一步促进CD8+T细胞的细胞毒性功能[11]。共抑制信号由共抑制分子与其配体(如PD-1与其配体PD-L1/PD-L2)之间的相互作用触发；这种相互作用导致CD8+T细胞产生的效应细胞因子下调[12]。本研究结果显示，Tn和Tcm中共刺激分子CD69、CD28表达高于Tem、Teff，而PD-1表达则低于Tem和Teff。说明Tcm有优于Tem、Teff的活化及增殖潜力，当再次暴露于抗原时，Tcm能迅速活化、扩增，并产生大量细胞因子(IFN-γ、IL-2)，从而促进肿瘤细胞死亡。

本研究检测了CD8+T细胞各亚群的差异基因，并采用基因富集分析发现这些基因主要富集在分化、凋亡、自我更新、STAT3通路等。趋化因子可以由树突状细胞产生，对CD8+T细胞的迁移和功能具有共刺激或共抑制的影响[13]。本研究结果显示趋化因子受体CCR7、CXCR4在Tcm中表达上调。CCR7是重要的淋巴结归巢标记，Tcm细胞表达这种淋巴结归巢受体分子，有利于它们在淋巴组织中的转移和保留[5-6]。CD8+T细胞通过TCR和CXCR4的刺激，增加激活性标志物CD69、CD25和CD154的表达，从而促进T细胞生长及IL-2、IFN-γ、IL-4的产生。本研究结果还显示STAT3通路相关基因在Tcm中表达水平增高。STAT3通路的IL-21信号可以使CD8+T细胞免于过度的炎症刺激，阻碍效应性CD8+T细胞的分化和衰竭，促进记忆性T细胞的形成[14]。干性相关基因(如C-myc、Lin28)在记忆性T细胞中表达上调，可以促进记忆性T细胞的维持和自我更新。Bcl-2在T细胞中的表达不仅能够抑制T细胞的凋亡，同时也参与调控T细胞与记忆性相关转录因子(如 FoxO1 和 Eomes)以及糖代谢相关基因(如HK2和Glut)的表达。

肿瘤浸润的CD8+T细胞发挥了重要的抗肿瘤作用，然而，由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，CD8+T细胞的功能受到抑制，使得多种有效的肿瘤免疫疗法疗效受到影响[15]。因此，通过调节与T细胞分化相关的基因及其通路，可以促进记忆性CD8+T细胞的形成。

综上所述，本研究发现，分化、抗凋亡、自我更新及STAT3通路等相关基因在Tcm细胞中表达水平较高。本研究探明了记忆性T细胞基因表达的特点，为体外诱导记忆性T细胞的形成提供了新思路。