萝卜硫素对HER2 CAR-T细胞分化、细胞内因子分泌及抗肿瘤作用的影响

申春一，张 震，田永贵，张 毅

1)郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院肿瘤中心 郑州 450052 3)河南省肿瘤免疫与生物治疗重点实验室 郑州 450052

基于嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)在临床治疗中的安全性及有效性，美国FDA已于2017年批准其上市[1-2]。然而在细胞制备及回输过程中，大部分CAR-T细胞分化为终末期的效应T细胞(effector T cell，Teff)，在体内难以维持长时间的抗肿瘤效应[3]。与Teff相比，记忆性T细胞具有强大的抗肿瘤能力，且在体内可以长期存活及分化，有较高的临床应用价值[4]。记忆性T细胞包括中心记忆性T细胞(central memory T cell，Tcm)和效应记忆性T细胞(effector memory T cell，Tem)，其分化受到多种机制的调控，已有研究[5]表明代谢在T细胞分化过程中发挥重要作用。Teff在分化为记忆性T细胞后其代谢方式由糖酵解转化为脂肪酸氧化和氧化磷酸化，即发生了代谢重编程[6]。有研究[7]报道，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作为代谢检查点可使糖酵解水平增加，而mTOR抑制剂雷帕霉素可抑制这一过程并促进T细胞记忆亚群的分化。作者的前期研究[8]结果也表明，抑制糖酵解或增加氧化磷酸化水平，可促进记忆性T细胞的形成。萝卜硫素(sulforaphane，SFN)是一种主要富集在十字花科植物中的天然营养素[9]，其对代谢有调控作用[10]，可通过影响糖异生过程控制血糖，并在2型糖尿病的治疗中显示出良好效果[11]。有文献[12]表明SFN可促进脂肪细胞褐化/脂肪酸氧化和葡萄糖有氧氧化。因此，本研究检测SFN处理后人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)CAR-T细胞糖酵解途径及脂肪酸氧化过程相关酶mRNA的表达，探讨SFN对HER2 CAR-T细胞分化及抗肿瘤效应的影响和可能机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂RPMI 1640培养基购自美国Sigma公司，胎牛血清购自美国Gbico公司，人外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司，人CD8分选磁珠、人CD3/CD28活化磁珠购自德国美天旎公司，流式抗体购自美国Biolegend公司，Trizol、Primescript RT reagent Kit购自日本TaKaRa公司，SYBR Green qPCR Master Mix购自德国Roche公司，重组人IL-2购自北京双鹭药业股份有限公司。

1.2HER2CAR-T细胞的制备及分组参考文献[13]分离、获取CD8+T细胞。采用序列合成方法将识别HER2抗原的HER2-scFv连接至CD28和CD3的信号区，再将其亚克隆入慢病毒载体中，测序验证HER2 CAR载体构建成功后，通过病毒包装(293T系统)及T细胞感染获得HER2 CAR-T细胞(效率达到60%以上)。将HER2 CAR-T细胞铺于24孔板中，每孔1×106个，设置为对照组及SFN组(加15 μmol/L SFN)，处理72 h后进行下列指标的检测。

1.3两组HER2CAR-T细胞分化的检测收集两组HER2 CAR-T细胞于1.5 mL离心管中，用PBS洗涤，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-PE和CCR7-PerCP，4 ℃孵育20 min后上流式细胞仪检测。CD45RO-CCR7+为Tn细胞，CD45RO+CCR7+为Tcm细胞，CD45RO+CCR7-为Tem细胞，CD45RO-CCR7-为Teff细胞。

1.4两组HER2CAR-T细胞中细胞内因子的检测以A549为靶细胞，以HER2 CAR-T细胞为效应细胞，按效靶比为10∶1共孵育，同时加入阻断剂BFA(1×)。6 h后收集细胞，PBS清洗后避光加入CD8-APC-Cy7，避光4 ℃孵育20 min后固定破膜，再避光加入胞内抗体IFN-γ-PE-Cy7和TNF-α-APC，检测两组细胞内IFN-γ及TNF-α的分泌水平。每组设3个复孔。实验重复3次。

1.5两组HER2CAR-T细胞杀伤能力的检测以A549为靶细胞，以HER2 CAR-T细胞为效应细胞，设置效靶比分别为1∶1、5∶1和10∶1，共孵育6 h。采用Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率越高代表HER2 CAR-T细胞的杀伤能力越强。每组设3个复孔。实验重复3次。

1.6两组HER2CAR-T细胞中糖酵解途径及脂肪酸氧化过程相关基因的检测将HER2 CAR-T细胞离心弃上清，加入1 mL Trizol提取总RNA，反转录后行PCR。反应体系(20 μL)：cDNA 2 μL，SYBR GREEN染料10 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40个循环；72 ℃ 10 min延伸。每组设3个复孔。实验结果采用2-ΔΔCt法分析。引物及序列见表1。实验重复3次。

表1 引物序列及产物大小

HK2：己糖激酶2；PFKM和PFKP：磷酸果糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；CPT1A：肉毒碱棕榈酰基转移酶

1.7统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析，应用两独立样本的t检验比较两组细胞分化、细胞内因子分泌水平、细胞杀伤能力、细胞中糖酵解途径及脂肪酸氧化过程相关酶mRNA表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组HER2CAR-T细胞分化的比较见表2。由表2可知，与对照组相比，SFN处理后Tcm细胞比例升高。

表2 两组HER2 CAR-T细胞分化的比较(n=3) %

2.2两组HER2CAR-T中细胞内因子分泌水平的比较见表3。由表3可知，与对照组相比，SFN能促进HER2 CAR-T细胞内因子的分泌。

表3 两组HER2 CAR-T细胞内因子分泌水平的比较

2.3两组HER2CAR-T细胞对A549杀伤能力的比较见表4。由表4可知，SFN组A549凋亡率高于对照组。

表4 两组HER2 CAR-T细胞对A549杀伤能力的比较 %

2.4两组HER2CAR-T细胞中糖酵解途径及脂肪酸氧化过程相关酶mRNA的表达结果见表5。由表5可知，经SFN处理后，HER2 CAR-T细胞糖酵解途径关键酶mRNA表达水平较对照组降低，脂肪酸氧化过程相关酶CPT1A mRNA表达水平较对照组升高。

表5 两组HER2 CAR-T细胞中糖酵解途径及脂肪酸氧化过程相关酶mRNA的表达(n=3)

3 讨论

SFN被看作是已知的所有天然抗癌物质中效果最好的活性成分，在体外和体内实验中均证实可以诱导多种肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞[14-15]。作者的前期研究[16]发现SFN可促进CD8+T细胞记忆前体细胞的分化。本研究结果显示，经SFN处理后HER2 CAR-T细胞记忆性T细胞亚群分化增多，IFN-γ及TNF-α分泌水平和杀伤活性增加，提示采用SFN处理CAR-T细胞有望成为体外扩增记忆性T细胞亚群并增强其功能的一种方法。

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞的代谢特征被称为Warburg效应，即在有氧条件下，肿瘤细胞也主要以无氧糖酵解的方式提供能量[17]。T细胞在静息状态下的代谢方式为氧化磷酸化，而经过刺激后其代谢方式转变为糖酵解[18]。CAR-T细胞也有相似的分化过程与代谢模式，如何通过调节代谢方式获得记忆性细胞是研究的重点。目前通过调节代谢影响T细胞分化的药物主要集中在靶向代谢检查点的激活剂或抑制剂[19-20]。本研究发现，SFN可抑制HER2 CAR-T细胞的糖酵解途径关键酶mRNA的表达，促进记忆亚群的形成。但SFN调控T细胞糖酵解的具体分子机制尚未阐明，有待进一步探究。

目前对于肿瘤患者的治疗提倡采用多种手段联合的综合治疗，CAR-T过继回输治疗与免疫检查点抑制剂、靶向药物等相结合，可获得更好的疗效[21-22]。本研究结果表明，SFN不仅促进记忆性T细胞的形成，还可增强其功能，因此将CAR-T细胞与SFN联合治疗可获得更好的抗肿瘤效果。

综上所述，本研究在体外实验证明了经SFN处理后HER2 CAR-T细胞抗肿瘤功能得到增强，并揭示了SFN可能通过抑制HER2 CAR-T细胞糖酵解途径促进记忆亚群形成，这为CAR-T细胞与SFN联用治疗肿瘤提供了实验基础。