LINGO-1介导Wnt7b促进脊髓神经干细胞增殖的作用

许 刚,赵晨光,克里木买买提,张 飞,何纯青

(1新疆军区总医院全军骨科中心,乌鲁木齐 830000;2空军军医大学第一附属医院康复医学科;3解放军第947医院骨科;*通讯作者,E-mail:edelweiss-zcg@126.com)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是神经系统的一种严重损伤,全世界脊髓损伤的年发病率为(10.4-83)/百万,在我国每年也约有1万余新发病例,患者在医治过程中耗费巨大的医疗资源和经济资源[1]。脊髓损伤后,髓鞘大量崩解,释放出髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors,MAIFs)[2],其可以通过与NgR/LINGO-1(LRR and Ig domain containing, Nogo receptor interacting protein)/P75复合受体结合,调控轴突再生、调控神经元存活以及调控少突胶质细胞成熟及再髓鞘化[3]。神经干细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)是具有自我复制、增殖及多向分化潜能的细胞,如何调控外源性移植和内源性激活的NSPCs,使其大量增殖并分化成为神经元及少突胶质细胞替代损伤后死亡的细胞,进而促进脊髓损伤后神经功能恢复成为相关领域倍受关注的问题[4]。Wnt信号通路是与NSPCs增殖、分化关系最为密切的信号通路之一,经典Wnt信号通路在神经系统发育过程中参与NSPCs的增殖分化、皮层模式发生、轴突形成等生命活动过程[5],但是其在脊髓源性NSPCs增殖过程的作用机制仍然不十分清楚。本研究旨在观察LINGO-1基因与Wnt7b基因相互作用关系,及其在脊髓源性NSPCs增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂

实验用SPF级别8周龄雌性C57BL/6小鼠由空军军医大学实验动物中心提供,动物饲养许可编号:SCXK(军)2012-007,并得到空军军医大学实验动物伦理委员会的许可。细胞培养用DMEM/F12、B27添加剂、N2添加剂、GlutaMAX添加剂及胎牛血清等均为Gibco公司产品;bFGF和EGF购于Peprotech公司,Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin购于Sigma公司,Nestin一抗购于Chemcon公司,Wnt7b一抗购于Abcam公司,LINGO-1一抗购于Abcam公司,荧光二抗Goat anti-mouse IgG,Goat anti-rabbit IgG购自Invitrogen公司。

1.2 成年小鼠脊髓NSPCs的分离培养

小鼠脊柱脱臼法处死,椎板减压暴露脊髓,取T1至T12节段脊髓置于预冷的PBS液中,用眼科剪剥离硬脊膜,将脊髓剪碎后加入Accutase中于3 ℃中消化30 min,加入培养基终止消化,离心后用培养基重悬,用火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打成单细胞悬液,并用40 μm滤网过滤,台盼蓝计数,按106/ml密度植于NSCs培养基(DMEM/F12+2%B27+1%N2+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)中,每3 d半量换液1次。生长至第7天时机械吹打法传代处理。每7 d传代1次,大于3代后进行实验。

1.3 病毒转染及RNA干扰

LINGO-1 shRNA慢病毒表达载体及Scramble表达载体构建及包装由上海吉凯生物基因公司提供,MOI=20 shRNA插入目标序列为:GTGAGAACAAGATCGTCAT,插入Scramble序列为:TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.4 mRNA转录组测序

LINGO-1基因RNA干扰后进行转录组测序筛选下游变化的mRNA。NSPCs经转染并鉴定后,至第5天收集悬浮培养的NSPCs,并分为LINGO-1 shRNA组以及Scramble组,两组内各收集3个生物学重复的NSPCs标本。标本收集后,干冰运输送北京诺和致源科技股份有限公司进行mRNA转录组测序。测序统计结果经校正后,显著性定义为q<0.05。统计分析后将显著性变化的mRNA进行GO富集分析,以分析功能学变化。

1.5 实时定量PCR检测Wnt7b的mRNA的表达水平

NSPCs标本加入1.0 ml TRIzol液提取细胞总RNA,利用逆转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA第一链,严格按照说明书操作。参照Genbank cDNA中的Wnt7b及内参GAPDH基因序列设计引物,Wnt7b上游引物:5′-TCTAGAGATGATCAGCTTGTGG-3′,下游引物:5′-TCTGTAAGCAGCTGATCGGTG-3′;GAPDH:上游引物:5′-CCTCTGGAAAGCTGTGGCGT-3′,下游引物:5′-TTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3′。PCR反应体系包括:10.0 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×),上游、下游引物(10 μmol/L)各2.0 μl,6.0 μl DNA模板。反应条件:95 ℃ 10 s预变性,95 ℃ 5 s、61 ℃ 30 s 40个循环。基因的相对表达采用2-ΔΔCt分析。其中实验组ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct,对照组ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct,ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.6 Nestin,LINGO-1,Wnt7b免疫荧光染色

吸弃NSPCs培养基,用PBS清洗1次以彻底去除残留的培养基,4%多聚甲醛固定30 min后用PBS清洗3次,每次5 min;加入0.3% Triton X-100通透5 min,PBS清洗2次。加入稀释好的一抗(Nestin 1 ∶200,LINGO-1 1 ∶100,Wnt7b 1 ∶200),4 ℃孵育过夜,次日吸弃一抗,PBS洗3次,每次5 min。加入稀释好的荧光二抗,37 ℃避光孵育2 h,PBS洗3次,每次5 min,DAPI封片剂,室温孵育30 min。镜下观察Nestin,LINGO-1,Wnt7b表达情况。

1.7 Western blot定量检测LINGO-1、Wnt7b表达

分别在干预后第5天收取NSPCs蛋白,吸弃培养液,用预冷的PBS清洗2次,以彻底去除残留的培养液。加入预冷的RIPA裂解细胞并转移入预冷的离心管中,离心后将上清转移至预冷的离心管中,用BCA对提取的蛋白进行定量。取蛋白样品,加入蛋白上样缓冲液,SDS-PAGE分离蛋白,湿转法将蛋白质转移至PVDF膜。将PVDF膜转移至含有5%脱脂奶粉的TBST封闭液中封闭1 h,加入一抗的稀释液(LINGO-1 1 ∶200,Wnt7b 1 ∶400),4 ℃过夜,次日TBST洗膜3次,每次10 min。将PVDF膜放入含稀释二抗的10 cm皿中,孵育1 h,在增强化学发光反应混合液中反应2-3 min,胶片显影并扫描。使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.8 流式细胞术检测细胞周期

NSPCs经70%冰乙醇处理4 h,然后进行碘化丙啶(propidium iodide)染色,流式细胞仪分析细胞周期(Beckman Epics XL-MCL)。

1.9 统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示。组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脊髓神经干细胞鉴定及LINGO-1 RNA干扰效率鉴定

原代培养的NSPCs在含有EGF和bFGF的培养液中贴壁生长,细胞成双极突起型梭状,折光性好。对贴壁的细胞进行鉴定,其表达NSPCs特异性标志物Nestin(>95%)(见图1A)。对NSPCs首先进行转染效率鉴定,在NSPCs转染慢病毒5 d后在荧光显微镜下观察,成功转染慢病毒的细胞呈GFP阳性,经过与同视野明场照片合并后观察到病毒转染效率达到90%以上(见图1B)。将成功转染LINGO-1 shRNA及scramble慢病毒的NSPCs进行蛋白免疫印迹检测,LINGO-1 shRNA组的LINGO-1蛋白表达下降至scramble组的0.42±0.067倍(P<0.05),其RNA干扰效果真实可靠(见图1C)。

2.2 LINGO-1下调NSPCs的增殖

为了进一步探究LINGO-1对NSPCs增殖的作用,下调LINGO-1表达后分析NSPCs的细胞周期,结果显示与scramble组相比较,LINGO-1组的S分裂期比例明显上升(23.6%±2.1%vs13.1%±1.7%,P<0.05,见图2),进入S期的比例增高,意味着有更多的细胞在进行增殖,提示下调LINGO-1表达可以提高NSPCs的增殖,即LINGO-1负性调节NSPCs的增殖。

2.3 LINGO-1下游mRNA变化的GO富集分析

为了进一步探索LINGO-1在NSPCs中的作用及机制,对其下游mRNA进行转录组测序并进行GO功能富集分析。富集结果分为生物学过程(biological process,BP),细胞成分(cell component,CC),分子功能(molecular function,MF)三部分。BP最主要富集在细胞学过程,CC最主要富集在细胞成分,而MF最主要集中在结合功能(见图3),其中Wnt7b为候选目的下游因子之一。

2.4 LINGO-1负性调节Wnt7b的表达

根据mRNA测序结果,对其中Wnt7b进行了验证。结果显示LINGO-1(绿色荧光)与Wnt7b(红色荧光)共表达于贴壁培养的NSPCs中(见图4A)。为了进一步验证LINGO-1和Wnt7b的作用关系,对LINGO-1进行RNA干扰,显示Wnt7b的mRNA水平上调至scramble组的3.4±0.22倍(P<0.05,见图4B),蛋白表达上调至scramble组的2.0±0.14倍(P<0.05,见图4C、D),以上结果说明Wnt7b为LINGO-1下游作用因子,下调LINGO-1可以使Wnt7b的mRNA水平和蛋白表达上升。

图1 NSPCs培养及LINGO-1RNA干扰效果鉴定Figure 1 Culture of NSPCs and identification of LINGO-1 RNA interference efficacy

图2 LINGO-1对NSPCs增殖的作用Figure 2 Effects of LINGO-1 on proliferation of NSPCs

图3 LINGO-1下游转录组测序及GO分析Figure 3 Transcriptome sequencing of downstream of LINGO-1 and GO analysis

与scramble组比较，*P<0.05图4 LINGO-1负性调节Wnt7b的表达 (bar=20 μm)Figure 4 LINGO-1 negatively regulates expression of Wnt7b (bar=20 μm)

3 讨论

神经干细胞是具有自我复制、增殖及多种分化潜能的细胞。由于其特殊的分化潜能,为脑及脊髓损伤后的神经修复带来了光明。瑞典卡罗林斯卡Frisen小组的一系列研究证实在小鼠室管膜区存在着“静止”状态的NSCs,在脊髓损伤等特定因素下可以被激活,从而出现增殖进而分化的现象,但是无论是这些内源性的NSCs还是移植外源性的NSCs,大多数都分化为星形胶质细胞,参与胶质瘢痕的形成。所以探究有效的作用靶点来调控NSCs的分化因素,提高神经细胞的分化率,抑制胶质瘢痕形成,是目前NSCs移植治疗脊髓损伤研究领域的热点话题之一。脊髓损伤后髓鞘大量崩解,形成髓鞘源性抑制因子(MAIFs),这其中包括Nogo-A、MAG和OMgp。以上这些因子可以通过NgR/LINGO-1/P75共同复合受体来发挥一系列的生物学作用,这其中包括:通过调控RhoA途径,终使生长锥塌陷而使轴突再生受阻[6];参与并下调EGFR,影响Akt通路而调控神经元存活[7];调控少突胶质细胞成熟及再髓鞘化。LINGO-1作为其中多重效应的重要作用节点,介导了多种生物学作用,但是其在脊髓神经细胞增殖的影响及机制仍然不明确。

本实验中发现下调LINGO-1的表达可以促进脊髓来源的NSPCs增殖,Lööv等[8]也检测过LINGO-1对皮层来源NPSCs增殖的作用,同样发现LINGO-1具有负性调节增殖的作用,尽管脊髓与皮层来源的NSPCs在生物学特征上具有一定的差异[9],但是LINGO-1对于其增殖作用的影响是相同的。为了进一步探求LINGO-1这一生物学作用的机制,通过转录组测序,筛选鉴定了下游作用因子Wnt7b。哺乳动物体内有19种Wnt蛋白,分成Wntl和Wnt5a两组,Wntl组包括Wnt1、Wnt3、Wnt10等,这些是通过经典的Wnt/β-catenin通路来发挥作用的。而Wnt5a组包括Wnt4、Wnt5a、Wnt 5b、Wnt7b等,是通过非依赖β-catenin通路来发挥作用的[10]。Viti等[11]发现Wnt7b可以促进神经前体细胞增殖,并且这一作用是依赖FGF来进行的。本实验同样验证了LINGO-1对Wnt7b的调控关系,下调LINGO-1基因可以使Wnt7b表达升高,结合以往的研究结果,可以推论在脊髓损伤后,脊髓源性NSPCs内LINGO-1表达上调,这导致Wnt7b下降,从而使其增殖受限,并可能最终影响了脊髓损伤后的神经功能恢复。

本研究没有进一步在动物活体内检测LINGO-1影响脊髓神经干细胞增殖的作用,这也是本研究下一步所努力的方向。明确LINGO-1对脊髓NSPCs增殖的作用及可能的机制可以使我们更加深入地了解LINGO-1的生物学功能,也为进一步促进脊髓损伤后内源性激活以及外源性移植的NSPCs增殖并促进神经损伤修复提供可能的作用靶点,为临床治疗脊髓损伤带来实验学基础。