甘草查尔酮A通过调控内质网应激促进脑胶质瘤细胞U251凋亡

徐高峰,鲍 钢,白晓斌,祁 磊,谢万福,李瑞春

(西安交通大学医学院第一附属医院神经外科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:lrckhz@163.com)

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,具有易局部播散、易复发等特点[1]。尽管关于脑胶质瘤治疗技术有了较大进步,患者预后有了较大改善,但脑胶质瘤的治疗仍缺乏突破性进展。探索脑胶质瘤的新型诊疗技术是神经科学界亟待解决的研究热点。

新疆甘草根作为治疗胃溃疡、支气管哮喘和炎症的传统药物已在世界范围内使用数千年,甘草查尔酮A(licochalcone A,Lico A)是其主要提取物[2]。Lico A具有多种药理学作用,如利什曼原虫[3]和疟疾[4]的抗寄生虫活性、抗炎活性[5]和抗肥胖活性[6],重要的是近几年发现其有抗肿瘤作用[7-9]。LicoA可诱导胃癌、宫颈癌和口腔癌的细胞凋亡[7,9,10];值得我们关注的是,有文献报道,Lico A具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用[11],但是其机制尚未阐明。

错误蛋白或未折叠在内质网(细胞内重要的细胞器)内聚集,损伤其正常生理功能,称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[12]。大量文献表明内质网应激介导凋亡信号可诱导细胞凋亡[13]。综上,本研究拟用脑胶质瘤细胞U251,探讨甘草查尔酮A促脑胶质瘤细胞凋亡的机制是否通过内质网应激。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器

DMEM培养基、胎牛血清(Gbico公司);甘草查尔酮A(Sigma公司);小鼠抗人Chop抗体、兔抗人GRP78抗体、兔抗人cleaved caspase-12抗体、兔抗人β-actin抗体(Abcam公司);生物素标记的山羊抗免(二抗)购自公司;生物素标记的山羊抗小鼠(二抗)购自Proteintech公司;胰酶、青霉素和链霉素混合液、ABC定量试剂盒、Hoechst33258染色液和ECL化学发光试剂盒均购自碧云天公司。

1.2 细胞来源与培养

U251为脑胶质瘤细胞株系,购自赛业生物科技有限公司。人胶质瘤细胞U251培养液中,胎牛血清 ∶DMEM为1 ∶9,另外每100 ml培养液加入青霉素和链霉素混合液,在细胞培养箱(5% CO2、37 ℃)中隔天传代培养。

1.3 CCK-8法检测Lico A对U251细胞增殖的抑制作用

收集对数期U251生长细胞,接种于96孔板,设置3个复孔,用含15,30,45 μmol/L的Lico A(即为Lico A低浓度组、Lico A中浓度组,Lico A高浓度组)处理U251细胞；另设control组，细胞用含10%的血清培养液处理。处理48 h,倒掉培养液,并用PBS清洗一遍,轻柔拍干,每孔加入20 μl的5 mg/ml MTT溶液,继续孵育4 h,弃去孔内液体,加入150 μl DMSO,震荡10 min,用酶标仪于490 nm处测定各孔吸光度值,计算细胞成活率。

1.4 Hoechst33258染色检测U251细胞凋亡情况

将对数生长期的U251细胞按1×105个/ml接种于6孔板中,置细胞培养箱中培养过夜,按实验设计对照组(即control组,用含10%的血清培养液处理U251细胞)和Lico A低浓度组、Lico A中浓度组,Lico A高浓度组(分别用15,30,45 μmol/L的Lico A处理U251细胞),均处理48 h。弃去培养液,用PBS进行洗涤细胞,轻拍干细胞培养板,加入4%多聚甲醛固定后用PBS洗涤细胞2次;再加入150 μl Hoechst33258染液,避光染色10 min,PBS洗涤细胞,在荧光显微镜下观察U251细胞形态及荧光强度。

1.5 Western blot检测凋亡相关蛋白和内质网应激相关蛋白的表达

为了观察Lico A处理对U251细胞中凋亡相关蛋白及内质网应激相关蛋白表达的影响,设置了control组(用含10%的血清培养液处理U251细胞)、Lico A低浓度组、Lico A中浓度组、Lico A高浓度组(分别含15,30和45 μmol/L的Lico A),待处理U251细胞48 h后,提取总蛋白。将经过蛋白定量后的蛋白取出,在每泳道加入15 μl的蛋白溶解物,根据蛋白分子量进行8%-12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),然后转移到PVDF膜上并用5%脱脂牛奶在Tris-缓冲盐水与吐温(TBST)在室温下孵育2 h。膜在4 ℃下分别与Bax、Bcl-2、GRP78、Chop或cleaved caspase-12抗体和5%脱脂牛奶(浓度均为1 ∶1 000)过夜孵育,然后与二抗和5%脱脂牛奶(浓度为1 ∶5 000)孵育2 h。最后通过使用增强的ECL化学发光,在显影仪(Biorad)上显影。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行实验数据处理,所有数据均采用均数±标准差表示,再行单因素方差分析组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘草查尔酮A对U251细胞增殖的抑制作用

结果显示,甘草查尔酮A处理U251细胞48 h后,15,30,45 μmol/L的甘草查尔酮A能浓度依赖性地降低U251细胞活力,与control组比较,差异有统计学意义(P<0.05,见图1),表明甘草查尔酮A能诱导U251细胞损伤。

2.2 甘草查尔酮A诱导U251细胞发生凋亡形态学改变

甘草查尔酮A处理U251细胞48 h后,与contol组比较,15,30和45 μmol/L的甘草查尔酮A可增加Hoechst33258染色阳性细胞数目(见图2),表明甘草查尔酮A能诱导U251细胞发生凋亡形态学改变。

与control组比较,*P<0.05,***P<0.001图1 甘草查尔酮A对U251细胞活力的影响Figure 1 Effect of licochalcone A on cell viability of glioma cells U251

2.3 甘草查尔酮A诱导U251细胞Bax蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达降低

与control组比较,15,30和45 μmol/L的甘草查尔酮A可浓度依赖性地上调U251细胞促凋亡Bax蛋白的表达,并下调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.05,见图3),表明甘草查尔酮A能诱导U251细胞凋亡。

2.4 甘草查尔酮A诱导U251细胞内质网应激相关蛋白GRP78、Chop和cleaved caspase-12蛋白表达的增加

与control组比较,15,30和45 μmol/L的甘草查尔酮A可不同程度地上调U251细胞Chop、GRP78和cleaved caspase-12蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.05,见图4),表明甘草查尔酮A通过诱导U251细胞内质网应激从而诱导细胞凋亡。

白色三角形标注所示为发生核固缩或破裂的细胞(透亮)A.control组; B.15 μmol/L Lico A组; C.30 μmol/L Lico A组; D.45 μmol/L Lico A组图2 Hoechst33258染色法检测U251细胞凋亡形态变化 (×200)Figure 2 Morphological changes of U251 cells apoptosis by Hoechst33258 staining (×200)

3 讨论

根据世界卫生组织分类,多形性成胶质细胞瘤是一种Ⅳ级星形细胞瘤,5年生存率约5%,最具恶性的原发性脑肿瘤[1],严重危害着患者及其家属的生活。目前它的治疗主要以手术、放疗和化疗手段为主,没有很大的进展,一种新型药物的开发对脑胶质细胞瘤显得尤为迫切。

甘草查尔酮A作为新疆甘草的提取物,已被证实具有多种药理学作用,其中包括抗肿瘤作用[7-9]。甘草查尔酮A对胶质瘤细胞的凋亡作用[11]已得到证实,但其具体的机制尚未阐明。故本研究拟探讨甘草查尔酮A促脑胶质瘤细胞凋亡的机制。

研究表明内质网应激与凋亡有着密切的关系,内质网应激过度就会干扰正常细胞的生理功能,从而诱导细胞发生氧化或凋亡[12,14]。因此,本研究提出了内质网应激是甘草查尔酮A促脑胶质瘤细胞凋亡的机制这一假说。本研究运用脑胶质瘤细胞株系U251细胞,探讨甘草查尔酮A诱导的细胞凋亡是否由内质网应激促发。

与control组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001图3 Western blot检测甘草查尔酮A对U251细胞凋亡相关蛋白表达的影响Figure 3 Effect of licochalcone A on the expression of apoptosis-related proteins in U251 cells by Western blot

首先,本研究为了明确甘草查尔酮A对U251细胞活力的抑制作用,用MTT法检测U251细胞活力,发现15，30和45 μmol/L的甘草查尔酮A能浓度依赖性地抑制U251细胞的增殖,表明甘草查尔酮可诱导U251细胞损伤。接着本研究分别用Hoechst33258染色法和Western blotting检测了不同浓度甘草查尔酮A处理后,U251细胞的凋亡情况和凋亡相关蛋白表达的变化。结果发现,15,30和45 μmol/L的甘草查尔酮A不仅可明显增加Hoechst33258染色阳性细胞数目,且可浓度依赖性地上调U251细胞促凋亡蛋白Bax(3B)并下调抗凋亡蛋白Bcl-2(3C)的表达,表明甘草查尔酮A能诱导U251细胞凋亡,该结果与多个实验室所做结果一致[15,16]。

最后,我们探讨了内质网应激是否是甘草查尔酮A促U251细胞凋亡作用的重要机制。

众所周知,内质网是一种多功能细胞器,负责调节蛋白质合成、折叠和组装。在外部刺激下,过量错误折叠的蛋白质在内质网内积聚并触发内质网应激。当内质网平衡被内质网应激扰乱并且不能通过细胞的自我调节能力恢复时,就会发生细胞凋亡或程序性细胞死亡[17]。几种途径被证明与内质网应激诱导的细胞凋亡有关,例如转录因子Chop,唯一一种位于内质网中的caspase成员cleaved caspase-12,GRP78,JNK途径等。本研究用Western blot检测了内质网应激相关蛋白(Chop、GRP78和cleaved caspase-12)的表达,发现15,30和45 μmol/L甘草查尔酮A处理48 h后,可不同程度地上调U251细胞Chop、GRP78和cleaved caspase-12蛋白的表达,甘草查尔酮A诱导U251细胞发生内质网应激,长期处于此状态下,可激活PERK/ATF4/CHOP、IRE1/JNK、Caspase等信号通路,从而介导细胞发生凋亡[18]。综上所述,表明甘草查尔酮A可通过诱导U251细胞内质网应激从而诱导细胞凋亡。

本研究的开展丰富了甘草查尔酮A促脑胶质瘤细胞凋亡的研究机制,为开发甘草查尔酮A治疗脑胶质瘤提供了新的理论依据,具有重要的意义。