miR-130b-3p通过靶向作用于INTS6促进肝细胞癌生长和转移

张 雷,王宇锋,王 亮,韩少山,殷国志,姚德茂,鲜 瑶,李瑞祥*

(1西安交通大学第一附属医院老年外科,西安 710061;2西安交通大学第一附属医院肝胆外科;3西安交通大学第一附属医院营养科;*通讯作者,E-mail:surgeonli@sohu.com)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球发病率及致死率较高的恶性肿瘤之一[1]。目前手术是治疗HCC的首选方案,但是手术、消融以及肝移植仅适用于10%-30%的HCC患者。因此,HCC患者的总体预后仍然不容乐观[1,2]。寻找新的有效的HCC临床诊疗措施是目前最为迫切的任务之一,肿瘤分子靶向治疗是近年来提出的新的肿瘤治疗策略[2-4]。作为靶向治疗领域之一的微小RNA(microRNA,miRNA)是一类由内源基因编码的长度为18-25个核苷酸序列的小分子RNA,其在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色[5]。miRNA主要通过参与基因的转录后表达调控而调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等恶性生物学行为[6]。既往研究发现,miR-130b-3p与前列腺癌[7]、膀胱癌[8]、子宫内膜癌[9]、上皮性卵巢癌[10]、乳腺癌[11]及甲状腺腺瘤[12]等肿瘤的发生发展密切相关。Leone等[12]发现,miR-130b-3p能够通过靶向作用于CCDC6基因促进甲状腺腺瘤的发生发展;Lv等[8]研究发现,在膀胱癌中,miR-130b-3p能够通过miR-130b-3p/PTEN/integrin β1通路发挥其促癌作用。但是miR-130b-3p在HCC中的表达及作用目前尚未见报道。生物信息学分析显示抑癌基因整合因子复合体亚基6(integrator complex subunit 6,INTS6)可能是miR-130b-3p的作用靶点。因此,HCC中miR-130b-3p可能通过靶向作用于INTS6发挥作用。综上,本研究旨在探究miR-130b-3p在HCC中的表达情况、临床意义及其对HCC细胞侵袭、迁移、增殖的影响,并初步探究miR-130b-3p是否能够通过靶向作用于INTS6,为HCC的预防和诊治提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本来源

收集65例HCC组织和对应的癌旁组织标本,所有标本均来自2009-01-01～2012-12-31在西安交通大学第一附属医院接受手术治疗并经术后病理诊断确诊的HCC患者,其中男性50例,女性15例,年龄25-74岁,中位年龄49岁。癌旁组织为距肿瘤边缘大于2 cm的肝组织,所有患者术前均未接受放疗、化疗等其他辅助治疗。所有获得的新鲜组织均尽快保存于液氮或者多聚甲醛(40 g/L)中。本研究获得西安交通大学第一附属医院伦理委员会审核批准,并且获得患者知情同意。

1.2 主要试剂

TRIzol试剂和脂质体(LipofectamineTM2000)均购自美国Invitrogen公司;胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;DMEM购自美国ThermoFisher Scientific公司;miRNA逆转录试剂盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA qPCR试剂盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-130b-3p特异性引物、miRNA内参U6引物、miR-130b-3p过表达类似物(miR-130b-3p mimics)、miR-130b-3p抑制剂(miR-130b-3p inhibitors)均购自美国Genecopoeia公司;Transwell小室购自美国BD公司;Matrigel基质胶购自美国BD公司;MTT试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司;RIPA裂解液(强)购自西安赫特生物科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;兔抗人INTS6多克隆抗体购自美国Abcam公司;小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;ECL发光剂购自美国Milipore公司。

1.3 细胞培养与转染

人正常永生化肝细胞(LO2)与肝癌细胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)均购自中科院上海生物化学与细胞生物学研究所。细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养条件为5%CO2、37 ℃。细胞转染参照LipofectamineTM2000试剂说明书步骤进行。将待转染细胞接种于6孔板,培养至细胞融合度约为70%。转染前24 h,将正常血清更换为无双抗10%胎牛血清的DMEM培养液。转染时,将100 nmol miR-130b-3p类似物(miR-130b-3p mimics)与100 nmol阴性对照、以及100 nmol miR-130b-3p抑制剂(miR-130b-3p inhibitors)与100 nmol阴性对照用LipofectamineTM2000分别进行转染,用无双抗10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养8 h,换成正常培养液进行培养,后续转染效果(比较转染前后miR-130b-3p的表达变化)检测及相关功能实验在转染24 h或者48 h收取细胞进行。

1.4 real-time PCR实验检测miR-130b-3p在HCC中的表达

应用TRIzol试剂按照说明书上的步骤提取组织和细胞中的总RNA,并应用超微量核酸定量光谱仪(Thermo Nanodrop 1000)测定RNA的浓度和纯度。逆转录操作分别按照miRNA逆转录试剂盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)说明书步骤操作。MiRNA real-time PCR步骤按照miRNA qPCR(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)试剂盒说明书进行,以U6为内参。结果均应用2-Ct法计算。独立重复实验3次。

1.5 Transwell迁移和侵袭实验检测HCC细胞迁移及侵袭能力

Transwell迁移实验时不铺胶;侵袭实验时,先按1 ∶6的稀释比例将50 mg/L的Matrigel胶稀释后均匀铺于上层小室底部。将待测细胞消化、离心、重悬,使细胞浓度为1×106个/ml。在Transwell下层小室中加入800 μl含100 ml/L胎牛血清的完全培养基,取各组细胞悬液200 μl加入Transwell小室的上室。每组重复3次。常规培养24 h,取出小室,首先用PBS溶液将小室清洗3次,然后用棉签将小室的微孔膜上层的Matrigel胶及细胞轻轻拭净,接着用40 g/L的多聚甲醛固定15 min,用1 g/L的结晶紫染色5 min,用PBS溶液洗净后将小室置于倒置显微镜下进行观察计数,每个样本随机选取5个视野进行计数并求其平均数,与对照组进行比较,以此评估细胞的侵袭迁移能力。

1.6 MTT实验检测HCC细胞增殖能力

转染各组细胞24 h,收集、调整细胞悬液的浓度,将细胞悬液接种至96孔板,使得每孔细胞数为3×103,各组细胞分别设置3个复孔,继续培养。分别于培养24,48,72 h各时间节点弃去培养基,每孔加入50 μl浓度为5 g/L的二苯基溴化四氮唑蓝(MTT),继续孵育4 h,每孔加入200 μl二甲基亚枫(DMSO)进行终止。然后应用光吸收酶标仪(SpectraMax 190,美谷分子仪器公司)测定490 nm处的吸光度并进行分析。

1.7 细胞蛋白抽提及Westen blot实验检测HCC细胞中INTS6的表达水平

细胞转染48 h,用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白,用BCA法进行蛋白定量。Westen blot实验时,首先将待检测蛋白样品按30 μg/孔上样,行SDS-PAGE,湿转法将蛋白转移至PVDF膜,用5%脱牛奶粉液封闭2.0 h,加入相应的INTS6抗体(稀释比例为1/1 000)或者β-actin抗体(稀释比例为1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜。次日取出膜,室温孵育30 min,TBST溶液洗膜3次,10 min/次,分别加HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(1 ∶5 000),室温孵育2 h。TBST洗膜3次,10 min/次,暗室用ECL发光剂检测。

1.8 荧光素酶报告基因实验

设计合成INTS6-3′-UTR的野生序列和突变序列并进行扩增,将扩增的片段分别转入pMIR-reporterTM的miRNA表达载体(Applied Biosystems),构建能够表达荧光素酶的重组质粒;构建好的重组质粒分别与miR-130b-3p mimic或miR-130b-3p inhibitors共同转染MHCC-97L细胞,常规培养72 h,收集细胞,严格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit说明书操作。最后通过发光化学仪检测萤火虫和海肾荧光比值。

1.9 统计学分析

应用统计软件SPSS 22.0处理数据,计量资料以均数±标准差表示,使用的统计学方法包括单因素方差分析、t检验、Pearsonχ2检验等;用Graphpad prism 6及Adobe PhotoShop CS6等软件进行图表的绘制。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-130b-3p在HCC组织和细胞中表达上调

应用real-time PCR检测65对HCC组织和对应的癌旁组织中miR-130b-3p的表达水平。结果表明,miR-130b-3p在HCC组织中相对表达水平显著高于癌旁组织(2.247±0.064 88vs1.205±0.027 80,P<0.001,见图1)。而且来自GEO数据库(GSE36915)的数据也表明,与癌旁组织相比,HCC组织中miR-130b-3p的表达水平明显上调(P=0.035 6,见图2)。此外,real-time PCR结果显示,5种HCC细胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)中的miR-130b-3p的表达水平均显著高于正常肝细胞LO2(均P<0.001,见图3)。

图1 real-time PCR检测miR-130b-3p在HCC组织和癌旁组织中的表达水平Figure 1 The expression of miR-130b-3p in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues by real-time PCR

图2 应用GSE36915的数据分析miR-130b-3p在HCC组织和癌旁组织中的表达情况Figure 2 Expression of miR-130b-3p in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues in GSE36915 data

2.2 miR-130b-3p的表达水平与HCC临床病理特征的关系

根据miR-130b-3p在HCC组织中的中位表达水平,65例HCC患者被分为两组:miR-130b-3p高表达组(n=33)和miR-130b-3p低表达组(n=32)。卡方检验分析结果显示,miR-130b-3p与肿瘤大小(P=0.015)、静脉侵犯(P=0.028)以及TNM分期(P=0.045)显著相关,而与年龄、性别等特征无显著相关(见表1)。

与LO2比较，***P<0.001图3 real-time PCR检测HCC细胞系中的miR-130b-3p的表达水平Figure 3 Expression of miR-130b-3p in HCC cell lines by real-time PCR

表1 miR-130b-3p的表达水平与HCC临床病理特征的关系(n=65)

Table 1 Correlation between miR-130b-3p expression and the clinicopathologic characteristics in HCC(n=65)

临床病理特征nmiR-130b-3p的表达水平高(n=33)低(n=32)χ2P年龄0.2280.633 <50岁18108 ≥50岁472324性别0.6650.415 男502426 女1596AFP水平0.8770.349 <400 ng/ml1174 ≥400 ng/ml542628肿瘤大小5.9090.015 <5 cm26188 ≥5 cm391524肿瘤数目2.5170.113 1472126 ≥218126静脉侵犯4.8260.028 无401624 有25178Edmondson病理分级1.2910.256 Ⅰ+Ⅱ361620 Ⅲ+Ⅳ291712TNM分期4.0340.045 Ⅰ+Ⅱ431825 Ⅲ+Ⅳ22157

2.3 miR-130b-3p对HCC细胞迁移和侵袭的影响

将miR-130b-3p类似物(miR-130b-3p mimics)、miR-130b-3p抑制剂(miR-130b-3p inhibitors)和相应的阴性对照转染至MHCC-97L细胞。real-time PCR检测结果显示,miR-130b-3p类似物能够显著上调MHCC-97L细胞中miR-130b-3p的表达水平(P<0.001),而miR-130b-3p抑制剂能够显著下调MHCC-97L细胞中miR-130b-3p的表达水平(P<0.001,见图4)。

Transwell迁移实验结果显示,相较于对照组,miR-130b-3p类似物能够显著促进MHCC-97L细胞穿过小室膜的数目(P<0.01);而转染miR-130b-3p抑制剂后的MHCC-97L细胞穿过小室膜的数目明显减少(P<0.01,见图5)。

图4 Real-time PCR检测转染miR-130b-3p类似物或者抑制剂后MHCC-97L细胞中miR-130b-3p的表达水平Figure 4 Expression of miR-130b-3p in MHCC-97 Lcells transfected with miR-130b-3p mimics or inhibitors by real-time PCR

图5 Transwell迁移实验检测miR-130b-3p表达量对MHCC-97L细胞迁移能力的影响Figure 5 Effect of miR-130b-3p on MHCC-97L cells migration by Transwell migration assay

Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,miR-130b-3p类似物能明显促进MHCC-97L细胞穿过小室膜(P<0.01);而miR-130b-3p抑制剂能明显抑制MHCC-97L细胞穿过小室膜(P<0.05,见图6)。

2.4 miR-130b-3p对HCC细胞增殖的作用

MTT结果显示,将miR-130b-3p类似物转染至MHCC-97L细胞,在继续培养48 h和72 h时间节点处,细胞增殖能力被显著增强(见图7A);而转染miR-130b-3p抑制剂后,48 h和72 h时间节点处,MHCC-97L细胞的增殖能力显著被抑制(见图7B)。

2.5 INTS6是miR-130b-3p的靶基因

应用生物信息学软件(microRNA.org,Targetscan和miRBase)预测miR-130b-3p的靶基因。如图8A所示,miR-130b-3p能够与整合因子复合体亚基6(INTS6,integrator complex subunit 6)的3′非编码区(3′-UTR)结合,提示INTS6可能为miR-130b-3p的靶基因。荧光素酶报告实验显示,miR-130b-3p能负向调节野生型的INTS6-3′-UTR荧光素酶的活性,而突变型的INTS6-3′-UTR的荧光素酶活性没有影响(见图8B)。进一步研究发现,与对照组相比,miR-130b-3p类似物显著降低INTS6的蛋白水平(P<0.001,见图8C,8D),而miR-130b-3p抑制剂显著上调INTS6的蛋白水平(P<0.001,见图8D)。

图6 Transwell侵袭实验检测miR-130b-3p表达量对HCC细胞迁移能力的影响Figure 6 Effect of miR-130b-3p on HCC cells migration by Transwell migration assay

与相应阴性对照比较，*P<0.05，**P<0.01图7 MTT实验检测miR-130b-3p表达量对HCC细胞增殖能力的影响Figure 7 Effect of miR-130b-3p on HCC cells proliferation by MTT

3 讨论

越来越多的研究表明,miRNA的异常表达与HCC细胞的发生发展密切相关[13]。例如,HCC中高表达的miR-367-3p能够通过靶向作用于雄激素受体从而促进索拉菲尼对肿瘤细胞的化疗效应[14];miR-485-5p能够通过靶向作用于EMMPRIN,从而抑制HCC细胞的侵袭迁移,进而影响HCC的进展[15]。值得注意的是,近年来研究发现miR-130b-3p可能与前列腺癌[7]、膀胱癌[8]、子宫内膜癌[9]及上皮性卵巢癌[16]等多种恶性肿瘤的的侵袭、转移、增殖、化疗药物敏感性以及患者预后等密切相关。这就提示miR-130b-3p可能与肿瘤的发生发展密切相关,具有可观的潜在临床价值。但是目前miR-130b-3p在HCC中研究尚罕有报道。

首先,本研究探究了miR-130b-3p在HCC中表达和临床价值。本研究显示,miR-130b-3p在HCC组织和细胞中表达量均显著上调。并且,高表达的miR-130b-3p与肿瘤大小、静脉侵犯以及TNM分期显著相关。上述结果表明,miR-130b-3p可能为HCC的促癌基因,并且可能具有一定的临床应用价值。

其次,本研究探究了miR-130b-3p对HCC细胞的迁移、侵袭及增殖能力的影响。为了探究miR-130b-3p对HCC细胞恶性生物学行为的影响,本研究应用Transwell迁移和侵袭实验以及MTT实验我们检测了miR-130b-3p表达量的改变对HCC细胞的迁移、侵袭及增殖能力的影响。结果显示,当HCC细胞中miR-130b-3p的表达水平改变之后,HCC细胞的侵袭、迁移及增殖能力也随之被正向调控。上述结果表明,miR-130b-3p为HCC的促癌基因,其能够促进HCC细胞的侵袭、迁移和增殖。

图8 生物信息学软件预测INST6是miR-130b-3p的靶基因及验证Figure 8 Prediction of the target gene of miR-130b-3p INTS6 and verification in HCC cells

最后,本研究探讨了miR-130b-3p对HCC细胞迁移、侵袭及增殖能力影响的作用机制。大量的研究表明,miRNA能够通过与下游靶基因的3′-UTR结合从而抑制靶基因的表达来发挥作用[17,18]。本研究中,来自多种生物信息学软件(Targetscan,microRNA.org and miRBase)的结果均显示,miR-130b-3p能够与INTS6基因的3′-UTR结合,即INTS6为miR-130b-3p潜在的靶基因。INTS6基因编码的蛋白是与RNA聚合酶II的C端相互作用的复合物的一部分,并参与snRNA的3′端处理;此外,INTS6也是候选抑癌基因[19,20]。已有研究发现,INTS6在前列腺癌[19]、HCC[21]、食管癌[22]等多种肿瘤中均可作为抑癌基因参与肿瘤的生物进程,其能够通过作用于Wnt/β-catenin通路调控肿瘤细胞的侵袭、转移、增殖能力等。值得注意的是,研究表明INTS6作为抑癌基因不仅能够通过作用于Wnt/β-catenin通路抑制HCC的发生发展,并且临床数据还表明其表达量与HCC患者的预后也密切相关[21,23]。因此,本研究中作出假设:miR-130b-3p可能通过靶向作用于INTS6发挥其抗HCC的作用。为了证实INTS6为miR-130b-3p的靶点,本研究应用荧光素酶报告基因实验和Western blot实验对这一假设进行了验证。结果表明,miR-130b-3p能够通过与INTS6的3′-UTR直接结合从而负向调控HCC细胞中的INTS6表达水平。上述结果表明,HCC细胞中,INTS6是miR-130b-3p的靶基因。结合既往研究,miR-130b-3p在HCC细胞中的可能作用机制为:miR-130b-3p通过靶向作用于INTS6,进而影响INTS6对Wnt/β-catenin信号通路等的调节,从而影响HCC细胞的迁移、侵袭以及增殖等。

综上所述,本研究通过一系列实验证明miR-130b-3p在HCC中高表达,并且与HCC的肿瘤大小、静脉侵犯及TNM分期密切相关。此外,miR-130b-3p能够通过靶向作用于INTS6促进HCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力。本研究结果将为HCC靶向治疗的相关研究提供一定的实验基础和理论依据。