差异表达的microRNA可能通过抑制MRGPRX2治疗过敏性哮喘

吴媛媛,王 珏,刘 昀,刘艳琴,孙秀珍*

(1西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科,西安 710004;2西安交通大学药学院;*通讯作者,E-mail:doc-ly@sohu.com)

过敏性哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,是外源性过敏原与机体免疫系统相互作用的结果[1-3]。环境中的过敏原,如屋尘螨(house dust mites,HDM)、内毒素以及病毒感染等均能够结合机体内不同病原体相关模式识别受体,进而激活不同的信号转导通路,促进相关炎症因子释放,激活并促进机体固有免疫以及获得性免疫反应的发生、发展,加重炎症反应进程。

Mas基因相关G蛋白耦联受体(Mas-related G-protein coupled receptor,MRGPR)属于新型G蛋白耦联受体,密切参与痒觉的机制调控。MRGPRX2是神经肽P物质、主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞的过氧化物酶、阿片类药物以及许多FDA批准的阳离子药物等的受体,其表达增加后通过调控下游信号通路,促进慢性炎症性疾病如痤疮、过敏性皮炎、慢性荨麻疹、重度哮喘等的进展[4]。Maes等[5]对重症哮喘患者的痰液样本进行分析,发现miR-223-3p、miR-142-3p以及miR-629-3p在哮喘患者痰液中水平显著增加,并与中性粒细胞呼吸道炎症有关,提示这些microRNA(miRNA)有助于哮喘的炎症表型进展。本研究旨在探讨miRNA和MRGPR的相互关系及在过敏性哮喘发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂

C57BL/6(MRGPRB2-/-)小鼠(敲除MRGPRX2基因,由贺浪冲教授馈赠),ECL发光试剂盒(美国Thermo公司),HE染色试剂盒(200T)、RIPA裂解液(200T)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(200T)(碧云天公司产品),卵清蛋白(OVA)(美国Sigma公司),山羊抗兔二抗和β-actin(北京中杉金桥生物技术有限公司),MRGPRB2抗体(购自美国Abcam公司),蛋白分子量标准、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、2×PCR Master Mix、DNA Marker、SYBR Green Mix(立陶宛Fermentas公司)等。

1.2 实验分组

24只C57BL/6小鼠分为正常对照组(control)、哮喘组(AR)、MRGPRB2-/-对照组、MRGPRB2-/-AR组,每组均为6只。哮喘组和MRGPRB2-/-AR组小鼠于第0和14天腹腔注射100 μl致敏剂(内含20 μg OVA、1 mg氢氧化铝),并在第21，22，23天,分别用1%(10 g/L)的OVA进行雾化吸入,30 min/d。对照组的致敏液和激发液均用生理盐水代替。实验结束2 d内处死取材。

1.3 利用在线数据库预测共同靶向MRGPRX2的miRNA分子

通过TargetScan/microRNA.org等在线数据库对共同靶向hMRGPRX2及小鼠MRGPRB2的miRNA分子进行了生物信息学预测及归纳,分析筛选了若干共同靶向MRGPRX2(人源)及MRGPRB2(鼠源)的miRNA分子。

1.4 real-time PCR检测共同靶向MRGPRX2的miRNA分子

用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,使用紫外分光光度计测定各样本中RNA的浓度。按反转录试剂盒说明书合成cDNA,并进行聚合酶链反应检测miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)表达。在冰浴的无核酸酶的离心管中加入1.2 μl RT Primer(1 μmol/L)、0.75 μl dNTP(2.5 mmol/L each)、4 μl 5×Buffer、0.25 μl RNase inhibitor,加ddH2O至总反应体系为19.8 μl;加0.2 μl(200 U)M-MLV,轻轻用移液器混匀;37 ℃温浴30 min,42 ℃温浴30 min;70 ℃加热10 min终止反应;荧光定量仪进行荧光定量分析。

1.5 HE染色观察气道炎症

取小鼠左肺组织,用石蜡包埋,切片用10%的甲醛固定,HE染色,光学镜下观察气管周围的炎性细胞浸润、上皮损伤情况。

1.6 Western blot检测小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平

提取小鼠肺组织中MRGPRB2蛋白,应用BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度定量试剂盒检测蛋白浓度。制备SDS-PAGE胶蛋白样品变性。制备浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为12%,在80 V恒压条件下电泳2.5 h。再用恒压80 V转印1.5 h,封闭一抗(1 ∶1 000),洗涤,孵育HRP标记的二抗(1 ∶5 000),再次洗涤,X线片曝光、显影。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 在线数据库预测出4个靶向MRGPRX2的miRNA分子

通过TargetScan/microRNA.org/等在线数据库预测共同靶向hMRGPRX2及小鼠MRGPRB2的miRNA分子,包括miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)(见图1)。

2.2 靶向MRGPRX2的miRNA分子存在差异表达

应用real-time PCR检测小鼠肺组织中miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)水平,结果显示,与对照组比较,AR组小鼠中miR-212(-3p)水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01,见图2);miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)水平亦有降低,差异亦具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

图1 生物信息学分析靶向hMRGPR的miRNA分子Figure 1 Bioinformatics analysis of miRNA targeting hMRGPR

2.3 HE病理切片染色结果

正常对照C57BL/6小鼠与MRGPRB2-/-小鼠肺组织结构基本正常,支气管黏膜比较完整,无明显炎症细胞浸润;与正常对照组比较,AR组小鼠肺组织出现支气管上皮细胞破坏,细小支气管周围存在较多炎性细胞浸润(如黑色箭头所示,见图3);而与AR组小鼠比较,MRGPRB2-/-哮喘小鼠对OVA刺激的气道炎症反应明显减弱(如黑色箭头所示,见图3)。

与control组比较,*P<0.05,**P<0.01;与AR组比较,#P<0.05图2 Real time PCR检测候选miRNA分子在各组小鼠肺组织中的表达Figure 2 The levels of miRNAs in the lung tissues were measured by Real-time PCR

图3 各组小鼠肺组织病理改变 (HE染色,×100)Figure 3 Pathological changes of lung in the four groups (HE staining,×100)

2.4 各组小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平比较

与正常对照小鼠比较,哮喘组小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平显著上调,而MRGPRB2-/-AR组小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平显著低于哮喘组(P<0.05,见图4)。

3 讨论

哮喘是影响全球3亿多人口的慢性呼吸道疾病,对公共医疗造成极大的经济负担[6,7]。在我国,随着经济快速发展以及工业化、城市化的加速,伴随着大量空气污染物排放,致使近年来我国的哮喘患病率不断上升[8]。过敏性哮喘是在遗传易感性的基础上经由环境因素(过敏原以及呼吸道病毒感染等)相互作用而发生的疾病,但具体机制尚未完全阐明。目前主要应用糖皮质激素和β2受体激动剂等传统药物治疗过敏性哮喘,无法有效控制和根除疾病。因此,阐明参与过敏性哮喘的关键调控蛋白及其具体分子机制,对于寻找治疗过敏性哮喘的新药物具有重大意义。

与control组比较,*P<0.05;与AR组比较,#P<0.05图4 Western blot检测小鼠肺组织中MRGPRB2表达Figure 4 Protein expression of MRGPRB2 in lung tissues detected by Western blot

国外研究[9,10]发现,在正常人肺组织中MRGPRX2处于低水平表达,而在哮喘患者肺组织的肥大细胞中MRGPRX2表达显著上调,可能与速激肽激活有关,后者是一种新发现的神经肽,由人支气管细胞和肺巨噬细胞产生,可参与IgE介导的过敏反应和肺部炎症,引起离体人支气管收缩。在本研究中,正常哮喘模型组小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平显著上调,而MRGPRB2-/-模型组小鼠肺组织中MRGPRB2表达水平显著低于正常模型组。

miRNA是一类内源性高度保守的单链小分子非编码RNA,长度约为21-25个核苷组,它通过与靶基因miRNA3′端非编码区配对结合,在转录后水平调控靶基因的表达,广泛参与机体的生理和病理过程[11]。miRNA在哮喘发病中的作用,亦逐渐引起哮喘及相关领域研究者的关注和重视。研究证实,miR-21、miR-155、miR-26、miR-133a与哮喘的发病密切相关[12]。

我们利用生物信息学分析筛选了一些共同靶向MRGPRX2(人源)及MRGPRB2(鼠源)的miRNA分子,其中包括miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)。我们进一步利用过敏性哮喘动物模型,对野生型C57BL/6与MRGPRB2-/-小鼠经OVA诱发哮喘后的肺组织样本进行检测,分析各组小鼠肺组织中miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)的表达水平,结果显示OVA刺激后,miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p和miR-495(-3p)表达差异均具有统计学意义。而当敲除MRGPRX2后,即MRGPRB2-/-AR组小鼠,与AR组相比较,miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p和miR-495(-3p)表达水平再次回升。

综上,我们推测,miR-212(-3p)、miR-132(-3p)、miR-590-3p、miR-495(-3p)可能通过抑制其靶基因MRGPRX2表达进而缓解过敏性哮喘症状,后期我们将更深入研究上述microRNA靶向调控MRGPRX2在过敏性哮喘中的具体分子机制。