聚类分析结合主成分分析评价不同产地枳壳药材的一致性与差异性

张智敏，聂 莼，李亚梅，彭买姣，彭江丽，林丽美*，罗 堃*

(1.湖南中医药大学 药学院，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学 湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室/湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心，湖南 长沙410208)

枳壳(FructusAurantii)始载于《雷公炮炙论》，宋代《开宝本草》首次将枳壳从枳实条目下分离出来，独立作为一种药物记载。2015年版的《中国药典》记载了其来源，为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，主要分布于我国长江流域及南方各省区。传统中医中枳壳主要用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂[2]。《中药炮制学》认为枳壳生品较峻烈，长于破气化痰，麸炒可以缓和其烈性，从而达到消积化痞的目的[3]。研究表明，枳壳的化学成分主要由黄酮类化合物、挥发油、香豆素类及少量的生物碱类组成[4,5]，具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗高血压[8]和抗休克[9]等活性。黄酮苷类是枳壳药理作用研究的主要物质基础，主要为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和橙皮素等[10]，被证实有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抑制毛细血管脆性等多种功效[11-14]。

目前中国药典以柚皮苷和新橙皮苷含量作为其质量控制指标，2015年版中国药典规定枳壳含柚皮苷(C27H32O14)不得少于4.0%，新橙皮苷(C28H34O15)不得少于3.0%。据文献[15]报道，不同产地的枳壳药材的柚皮苷和新橙皮苷含量存在差异，其中传统产区如江西、四川、湖南等地的枳壳药材质量相对较佳。

本研究通过HPLC指纹图谱结合聚类分析、主成分分析对不同产地枳壳质量进行较为系统的评价，以期为枳壳质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters高效液相色谱仪(包含E2695四元梯度泵，2489UV检测器，Empower3软件)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版(国家药典委员会)；SB25-12DT型超声波清洗仪(新芝公司)；CP114分析天平(美国奥豪斯)。

1.2 材料

芸香柚皮苷对照品(批号MUST-16030408)，购于成都曼斯特生物科技有限公司；柚皮苷对照品(批号10552-201301)、橙皮苷对照品(批号10089-201203)、新橙皮苷对照品(批号10477-201203)，购于南昌贝塔生物科技有限公司；橙皮素对照品(批号B20184)、川陈皮素对照品(批号B20199)，购于上海源叶生物科技有限公司。

水为超纯水，乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

枳壳药材经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，详细信息见表1。

表1 枳壳样本信息

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备

分别精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素对照品适量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.022 7 mg/mL、0.005 9 mg/mL、0.016 7 mg/mL、0.008 0 mg/mL、0.000 8 mg/mL、0.000 6 mg/mL的混合对照品溶液，避光保存。

2.2 供试品溶液制备

取枳壳样本打粉过筛，精密称定0.2 g，置于具塞离心管中，精密加入70%甲醇10 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，取滤液，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～6 min，20%～23%乙腈；6～13 min，23%～35%乙腈；13～16 min，35%～55%乙腈；16～26 min，55%～70%乙腈；流速1.0 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的峰面积的RSD分别为1.23%、0.32%、0.13%、0.18%、0.48%、0.38%(n=6)，表明仪器精密度良好。混合对照品的HPLC色谱见图1。

图1 混合对照品HPLC色谱

2.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液(S33)，分别于制备后0、4、8、12、24 h后进样10 μL，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的峰面积的RSD分别为0.72%、0.58%、1.12%、0.53%、0.70%、0.65%。表明供试品溶液在24 h内性质稳定。

2.4.3 重复性试验 取样品(S33)适量，平行制备6份供试品溶液并依法测定。结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的峰面积的RSD值分别为1.19%、1.17%、1.19%、1.39%、0.95%、1.26%(n=6)。表明本试验重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验 精密称取已测定的样品(S33)6份，每份0.1 g，分别加入一定量的对照品，按照供试品溶液的制备方法制备样品溶液，进行回收率测定。结果表明，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的加样回收率的RSD值分别为1.32%、1.89%、1.50%、1.77%、2.41%、2.28%。表明该方法的准确度良好。

2.4.5 枳壳中6种黄酮类成分含量测定 以混合对照品中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素的浓度和HPLC峰面积为标准，分别计算37批次不同产地枳壳药材中该6种黄酮类成分所占的百分含量。结果见表2。

表2 枳壳中六种黄酮类成分的百分含量 (%)

从表2可以看出，不同产地的枳壳药材，其化学成分存在差异，甚至同一地区的枳壳药材质量也并不统一，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陈皮素含量均不高的枳壳样本有S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S18、S20、S21、S26、S27。

此外，通过对比S1和S8、S2和S7、S3和S6、S30和S34、S31和S35、S32和S36可以发现，枳壳生品经麸炒炮制后，黄酮类成分含量有所下降，与文献[16-17]报道的枳壳麸炒前后色谱行为一致，但成分含量普遍减少的结论相符合。S30～S33反映的是同一种植地的枳壳药材于不同采收期的样本。从表2可以看出，4个不同采摘期的枳壳药材中柚皮苷和新橙皮苷的含量均符合药典标准，其中7月5日采摘的枳壳生品(S31)的黄酮类成分含量最高，随着采收时间的推后，其含量呈现下降趋势。该结论与李正红等[18]研究结果一致。据报道，枳壳从7月初至8月初均可采集，随着枳壳成熟度的增加，总黄酮含量呈现下降趋势，但柚皮苷和新橙皮苷含量则呈上升趋势[19]。随着枳壳成熟度的进一步增加，果瓤迅速增大，果皮变薄，柚皮苷和新橙皮苷含量下降[20]。因此，枳壳于大暑前后采摘整体品质最佳。

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 枳壳指纹图谱的建立 按照“2.2”项下方法制备37批次枳壳药材供试品，按照“2.3”项下方法测定，记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统以37批枳壳色谱图为基础建立标准指纹图谱(见图2)，确定19个共有峰，生成对照图谱(见图3)，与对照品溶液比对，鉴定3号峰为芸香柚皮苷、4号峰为柚皮苷、5号峰为橙皮苷、7号峰为新橙皮苷、15号峰为橙皮素、19号峰为川陈皮素。

图2 37批次枳壳药材指纹图谱

2.5.2 枳壳药材相似度评价 以中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成的枳壳对照指纹图谱为标准，计算相似度(结果见表3)。结果表明，37批枳壳药材中，除了S1、S5、S8和S18，其余样本的相似度均大于0.90。

表3 相似度评价结果

2.5.3 主成分分析 主成分分析也称主分量分析，是利用降维的思想，将多个变量(指标)化为少数几个互不相关的综合变量(指标)的统计方法。主成分分析在求出主成分后，选择前P个主成分，构造综合评价函数可对样品进行综合评价。主成分个数的选取按以下原则来确定：①以累积贡献率来确定，当前P个主成分的累积贡献率达到某一特定的值时(一般以>70%为宜)，则保留前P个主成分；②以特征值大小来确定，即若主成分的特征值≥1，则保留该主成分[21]。采用SPSS 17.0软件对37个不同产地枳壳药材的19个共有峰(变量)峰面积原始数据进行标准化处理，以主成分的特征值及贡献率为依据，进行主成分分析，解释的总方差结果见表4，碎石图见图5。

表4 解释的总方差

图5 碎石图

结合表4和图5可知，枳壳药材的主成分分析中前5个主成分的特征值均大于1，且碎石图的连线较陡峭，累积方差贡献率为86.435%，可以反映整体指标86.435%的信息，因此提取前5个主成分进行分析较为合适。

成分载荷矩阵反映各主成分与原始指标之间相互关系的密切程度与作用的方向[21]，载荷的绝对值越大，其对于主成分的影响就越大。本研究的相关系数矩阵结果见表5所示。

表5 成分载荷矩阵

从表5可以看出，第一主成分与原始变量峰10、峰11、峰15、峰6、峰16、峰18之间的关系最为密切(载荷绝对值>0.8)。

以第1、第2、第3主成分为变量得到的三维投影载荷图(图6)，在投影图中距离原点较远的点，峰1、峰2、峰3(芸香柚皮苷)、峰5(橙皮苷)、峰7(新橙皮苷)对区分不同产地的枳壳药材起到较大作用。

图6 载荷图

通过计算主成分得分、综合得分[22]，可对不同产地的枳壳药材品质进行评价。以前5个主成分贡献率为权重系数，对不同产地的枳壳药材进行综合评价，计算主成分得分及综合得分，结果见表6。

表6 不同产地枳壳主成分得分、综合得分及排名

由主成分排名可知，湖南沅江和江西新干产地的枳壳药材质量最佳。同一种植地而不同采收期的枳壳药材(S30-S33)中，7月5日采摘的枳壳生品(S31)质量最佳，与黄酮类成分的含测结果一致。

2.5.4 聚类分析 聚类分析是将样品按照品质特性相似度逐渐聚合在一起，最终按照类别的综合性质将多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程。本研究应用SIMCA 13.0分析软件进行层序聚类分析，得到分类聚类树状图(图7)。

从图中可知，在类间距为50时，S13、S14、S15、S19、S23、S25、S28、S29聚为一类，这些样本的黄酮含量均较高，且主成分排名位于前10，该类样本主要为湖南沅江和江西新干产地的枳壳药材；六种黄酮含量均不高，且主成分排名末尾的样本S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S12、S18、S20、S26、S27聚为了一类，该类样本主要为湖南、江西、四川不明具体产地信息的网购及非种植地销售枳壳药材；剩余的样本S7、S9、S10、S11、S16、S17、S21、S22、S24、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37聚为一类，该类样本主要为湖南、四川产地的枳壳药材。聚类分析的结果与主成分分析以及含测结果均吻合，与相似度评价结果大体一致。

图7 37批次枳壳样品的HCA树状图

3 讨论

本研究通过聚类分析结合主成分分析，以及主要黄酮类成分含量测定分析，发现不同产地的枳壳药材的化学成分存在差异，且同一地区的枳壳药材质量也并不统一，说明影响药材质量的因素不仅为产地，采收时间、加工等环节也影响着药材的质量。