2种新型ω-芋螺毒素的合成及作用靶点鉴定

周良燚，陈金琴，余硕，陈必链，戴秋云

1.福建师范大学 生命科学院，福建 福州 350117；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

芋螺毒素是由芋螺毒腺分泌的一类活性短肽，通常由12～40 个氨基酸残基组成，富含二硫键。根据其保守的信号肽序列和半胱氨酸框架，芋螺毒素可分为A、M、O、P、S、T、I、V、Y、J 等 20多个超家族[1-2]；根据其药理学靶点的不同，芋螺毒素又可分为α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、加压素、惊厥剂、睡眠肽等药理家族[3-4]。ω-芋螺毒素由24～29个氨基酸残基组成，含3 对二硫键，半胱氨酸骨架结构为C-C-CC-C-C，二硫键连接方式为C1-C4、C2-C5、C3-C6[5]，主要作用于 N、P/Q 及 L 型钙离子通道[2,6-7]。类似ω-芋螺毒素半胱氨酸骨架结构的还有δ、μO、κ及γ家族芋螺毒素，分别作用于钾离子通道（如κ-PⅦA[8]）、钠离子通道（如μO-MrⅥB[9]）、nAChR（如δ-TxⅥA[10]）等。

N 型钙离子通道与疼痛位点的信息传递密切相关[11]。2004年美国上市的第1 个ω-芋螺毒素镇痛药物MⅦA 对晚期癌症、神经疼等有效,但其具有严重的副作用，如眩晕、行走失禁、幻想、震颤等症状，影响了其用药适从性[12-14]。本实验室发现的SO-3 对N 型钙离子通道的抑制作用和MⅦA相当，且SO-3 对金鱼的毒性显著低于MⅦA，对小鼠的行动影响也低于MⅦA[14]，目前SO-3 已经完成了临床前研究试验。为发现新的N 型钙离子通道的抑制剂，提供活性高、副作用低的镇痛分子，我们合成了来自泡芋螺（Conus bullatus）的2 种新型ω-芋螺毒素 Bu1（序列 CKGPGAKCLKT⁃MYDCCKYSCSRGRC-NH2）及Bu13（序列CKGPGA⁃SCIRIAYNCCKYSCRNGKC-NH2）[15]，并测定其作用靶标。结果表明，Bu1 和Bu13 选择性作用于N 型钙离子通道。该工作为设计新型N 型钙离子通道抑制剂提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293T 细胞（ATCC）；鼠源电压门控钙通道质粒（α1B、α1A、α1C、α2δ1、β3）、eGFP（本实验室保存）；Fmoc-氨基酸、HOBT、HBTU（上海吉尔生化公司）；DIEA（北京伊诺凯科技有限公司）；Rink 树脂（天津南开和成科技有限公司）；胎牛血清、DMEM 培养基、0.25%胰酶-EDTA、Opti-MEM培养基（Gibco 公司）；LipofectAMINE 2000 转染试剂（Invitrogen 公司）；BaCl2·2H2O、MgCl2·2H2O、CsCl、NaCl、HEPES、CsOH 水溶液、N-甲基-D-葡萄糖胺（Sigma 公司）；其他试剂均为分析纯。

Sophas 多肽合成仪（Zinsser Analytic 公司）；CO2细胞培养箱（Thermo Scientific 公司）；微电极拉制仪（P-97，Sutter 公司）；数模转换器（DigiData 1440A）、放大器（Multiclamp 700B）（Molecular De⁃vices 公司）；微操纵仪（MP-285，Sutter 公司）；放大器（Axoclamp 900B，Molecular Devices 公司）；倒置荧光显微镜（IX-71，Olympus 公司）；多通道灌流设备（MPS-2，武汉华中仪博公司）；细胞灌流槽（RC-24N，Warner Instruments 公司）；恒流蠕动泵（保定兰格公司）。

1.2 线性肽的合成、折叠、富集和纯化

采用固相法合成[6]。称取0.05 mmol Rink 树脂，配制0.3 mmol Fmoc-氨基酸、偶合剂（0.6 mol/L HOBT、HBTU）、DIEA 及脱保护剂（30%哌啶），用Sophas 多肽合成仪合成，得到肽树脂。

肽树脂中加入裂解液（0.25 g DTT，0.2 mL三异丙基硅烷，0.25 mL H2O，4.4 mL TFA），搅拌3 h，过滤，旋去大部分TFA，加入无水乙醚，沉淀多肽，G4 漏斗过滤收集多肽。

线性肽（约50 mg）溶于200 mL 折叠液（0.5 mol/L NH4Ac，1 mmol/L 谷胱甘肽，0.1 mmol/L 氧化谷胱甘肽，pH 值调至 8.0～8.2）中，4℃折叠 24～48 h，HPLC 监测折叠进程。折叠完成后用乙酸调节pH 值为4.5，终止反应。用反相制备柱富集，反相半制备柱纯化，得到目标肽。多肽送北京蛋白质组研究中心进行质谱鉴定。

1.3 圆二色谱测定

多肽溶于0.01 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.2），浓度为 35 μmol/L。室温下，采用 Chirascan Plus 圆二色光谱仪（应用光物理公司）进行测定，λ=190～260 nm，d=1 mm，空白对照为0.01 mol/L 磷酸缓冲液，重复测定3 次。

1.4 全细胞膜片钳检测多肽对钙离子通道的抑制活性

将鼠源钙通道质粒（α1、α2δ1、β3，各1 μg）及eGFP（0.2 μg）（其中N 型钙通道的α1 亚基为α 1B，P/Q 型钙通道的为α1A，L 型钙通道的为α1C）用 LipofectAMINE 2000 转染至 HEK293T 细胞，表达24 h。细胞消化后加至多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，于37℃、5% CO2培养箱中培养4 h 左右，进行膜片钳实验。

膜片钳实验参见我们先前方法[14]。电极内液为 140 mmol/L CsCl、10 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES 及 1 mmol/L EGTA，用 CsOH 调节 pH 值为7.3；细胞外液为135 mmol/L N-甲基-D-葡萄糖胺、20 mmol/L BaCl2·2H2O、2 mmol/L MgCl2·2H2O 及 10 mmol/L HEPES，用 HCl 调节 pH 值为7.2。采用数模转换器（DigiData 1440A）记录原始电流值变化，用Multiclamp 700B 放大器将电流放大，在室温下（23～25℃）进行全细胞膜片钳记录。各试验参数如下：钳制电压-80 mV，激发电压+10 mV，持续 200 ms，10 s 每周期，电流信号经 2 kHz 低通滤波器处理，采样率为5 kHz。

原始数据用Clampex 10.3 处理，获得对照组和给药组的峰电流I，计算出响应率（I/I0）和抑制率（1-响应率）。用如下GraphPrism（GraphPad Software）的Hill 方程拟合剂量-抑制活性曲线获得IC50：

其中，I0表示峰电流的最大值，［CToxin］代表抑制剂的浓度，IC50为半抑制浓度，nH 代表 Hill 系数。

2 结果

2.1 多肽的合成与纯化

Bu1 及Bu13 线性肽、折叠溶液和纯化后产物的HPLC 见图1。结果表明，Bu1 线性肽折叠产生1 个主峰，Bu13 线性肽折叠获得2 个主峰。由于ω-芋螺毒素的二硫键连接方式为C1-C4、C2-C5、C3-C6，为紧凑型球状结构，一般在HPLC 分析中出峰较早，因此出峰早者为目标肽。Bu1 及Bu13 纯品肽纯度均大于95%，经质谱测定，与理论计算值一致。

2.2 圆二色谱

Bu1 及Bu13的CD谱见图2。理论上多肽的α螺旋结构在 222、208 nm 处呈负峰，190 nm 附近为正峰；β折叠在 217～218 nm 处显负峰，195～198 nm 显正峰；无规卷曲的CD 谱在198 nm 附近有一负峰。结果表明，Bu1 及Bu13 在220 nm 附近有一小而宽的正峰，说明该二肽均含有β折叠，但含量较MⅦA的β折叠稍低。

2.3 Bu1及Bu13对N型钙离子通道的抑制活性

对N 型钙离子通道的抑制活性见图3及表1。结果表明，Bu1 及 Bu13 一峰的 IC50分别为 0.87及1.03 μmol/L，较MⅦA（0.21 μmol/L）活性低，Bu13 二峰无活性。

图1 Bu1和Bu13线性肽、折叠液及纯肽的HPLC分析

图2 Bu1、Bu13的圆二色谱图

2.4 Bu1及Bu13对P/Q及L型钙通道的抑制活性

10 μmol/L Bu1 及 Bu13 对 P/Q 及 L 型钙离子通道的抑制活性见表1。10 μmol/L Bu1 及Bu13对P/Q 型钙离子通道的抑制率分别为17.05%及13.1%，略高于MⅦA（8.92%）；10 μmol/L Bu1 对L型钙离子通道的抑制率为19.31%，Bu13 与MⅦA对L 型钙离子通道的抑制活性低（＜5%）。

3 讨论

MⅦA的构效关系研究表明，Lys2、Arg10、Leu11、Tyr13、Arg21、Arg24及 N 端的氨基是功能氨基酸[16-17]。Bu1、Bu13 与MⅦA的氨基酸差别主要为loop1的第 4、loop2的第 9、loop3的第 17、18 位残基。MⅦA loop1的第4 位残基虽然不是关键氨基酸，但引入Pro 可能改变了分子构象（图2），影响Bu1及Bu13的抑制活性。Bu1和Bu13的loop2第9位残基是疏水氨基酸，而MⅦA的第9位残基为Ser，其他作用于N 型钙通道的ω-芋螺毒素在该位置也为Ser 或碱性氨基酸，如SO-3、CⅥD、MⅦC等[18-20]，因此我们推测Bu1和Bu13的loop2第9位疏水氨基酸残基可能影响活性。此外，Bu1 及Bu13的 loop3 第 17、18 位残基为体积较大的 Tyr 及Lys，与其他ω-芋螺毒素此处为 Thr（Ser）及Gly显著不同，也可能影响其活性。

M ⅦC的结构活性关系研究表明，Arg9、Lys10、Arg22、Arg23是结合 P/Q 型钙离子通道的重要氨基酸[20]。相对 Bu13 而言，Bu1的第Ⅳ个 loop的碱性氨基酸Arg的排列不同，其与MⅦC 类似，但Bu13 与MⅦA的loop4 碱性氨基酸排列类似，因此推测Bu1 有稍高的P/Q 钙离子通道结合活性可能与其第Ⅳ个loop的碱性氨基酸残基有关。

另外，Bu1 对L 型钙离子通道的抑制活性高于MⅦA，但Bu13 及MⅦA 对L 型钙离子通道的活性很低。但有关ω-芋螺毒素对L 型钙离子通道的结构活性关系研究很少，Bu1 有一定的L 型钙离子通道抑制活性的原因尚不清楚。

总之，我们合成了2 种新型ω-芋螺毒素，并对其作用靶点进行了鉴定，发现Bu1、Bu13 选择性作用于N 型钙离子通道，对P/Q、L 型钙离子通道的抑制作用较低。该工作为研究ω-芋螺毒素构效关系及设计新型N 型钙离子通道抑制剂提供了依据。

表1 ω-芋螺毒素Bu1及Bu13对钙离子通道的抑制活性

图3 Bu1及Bu13对N型钙离子通道的抑制活性