可诱导型敲低PICH的MDA-MB-231细胞系的构建及鉴定

李万金，黄燕，吕璐冶，韩秋影，周涛，陈亮

国家生物医学分析中心，北京 100850

乳腺癌作为女性肿瘤致死最主要的原因，其病理特征与治疗靶点具有多样性[1-3]。根据肿瘤的分子分型，乳腺癌可分为三阴乳腺癌、Luminal A 型、Luminal B 型及 HER2 过表达型等 4 种亚型，其中15%～20% 为三阴乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）[4-6]。与其他 3 种亚型不同，三阴乳腺癌同时缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、表皮生长因子受体2（HER2）3 种靶点的表达，所以传统的内分泌治疗和靶点治疗对其治疗效果并不理想[7-9]。因此，针对三阴乳腺癌的治疗，亟需探寻新的靶点与策略[10-11]。

polo 样激酶1 相关检查点解旋酶（polo-like kinase1-interacting checkpoint helicase，PICH）属于SNF2 家族，具有DNA 解旋酶活性，是有丝分裂后期姐妹染色单体分离的重要调控分子[12-13]。研究表明，作为有丝分裂关键调控激酶CDK1、PLK1的磷酸化底物，PICH 在有丝分裂期被招募至着丝粒，与BLM、TOPⅡ形成复合物，进而通过水解ATP 提供能量，保证姐妹染色单体在细胞有丝分裂后期正确分离；当PICH 缺失时，着丝粒DNA 不能正常断裂，导致微核或多核的产生，严重时造成细胞分裂异常[14-16]。此外，有研究表明PICH 在胚胎发育过程中也发挥重要作用[17]。

本实验室前期研究表明三阴乳腺癌患者的肿瘤组织中PICH 呈高表达，且PICH 高表达的患者预后较差，提示PICH 可能参与调控三阴乳腺癌的发生发展。为了验证这一想法，我们构建了可诱导稳定敲低PICH的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231，为进一步深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231、HEK293T 细胞购于ATCC，由本实验室冻存保种；大肠杆菌DH5c 感受态细胞、2×上样缓冲液购于北京博迈德基因技术有限公司；嘌呤霉素抗性的pLKO.1-tet-on 载体质粒购于 Addgene 公司；DMEM 基础培养基、1640 基础培养基、胰蛋白酶、双抗（青霉素、链霉素）及钙转试剂盒购于迈晨科技有限公司；胎牛血清购于Gibco 公司；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、AgeⅠ及T4DNA 连接酶购于赛默飞世尔有限公司；琼脂糖购于GenStar 公司；PICH 抗体和Tubulin 抗体分别为Sigma 公司和CST 公司产品。

1.2 细胞培养

HEK293T 细胞用DMEM 培养基培养（含10%胎牛血清及1%双抗），MDA-MB-231 细胞用1640培养基培养（含10%胎牛血清及1%双抗）。

1.3 PICH shRNA设计

从 Public TRC Portal 数据库（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/）中选取人源PICH特异的shRNA 序列，且该序列适用于pLKO.1 载体构建（表1、2）。

1.4 PICH shRNA慢病毒质粒的构建与鉴定

用ddH2O 将合成的PICH 干涉引物稀释至100 mmol/L；各取1.25 μL 互补单链与5 μL 10×退火缓冲液加入42.5 μL ddH2O 中混匀，将混合液置于95℃水中加热10 min 后，缓慢冷却至室温，完成引物退火；取5 μg pLKO.1-tet-on 载体质粒与5 μL 10×酶切缓冲液混合，再用ddH2O 补齐至45 μL，最后分别加入2.5 μLEcoRⅠ和AgeⅠ酶，配成酶切体系，37℃酶切4 h；利用核酸电泳分离酶切产物，并回收酶切片段产物；各取1 μL酶切回收产物、10× T4缓冲液、T4DNA 连接酶与7 μL 退火产物混匀配成10 μL 连接体系，37℃连接 1 h；取 5 μL 连接产物加入 50 μL 大肠杆菌DH5α感受态细胞溶液中混匀，配成转化体系，冰浴30 min；快速将转化体系转移到42℃水浴锅中热激 90 s，冰浴 2～3 min；取 400 μL 不含抗生素的无菌LB 液体培养基加入装有转化体系的试管中，于37℃摇床上孵育1 h；室温低速离心3 min，弃300 μL 上清，重悬菌液后，均匀涂在含氨苄青霉素的LB 平板上，37℃培养箱中过夜；菌落PCR鉴定，基因测序验证。

表1 PICH干涉靶序列

表2 PICH干涉序列

1.5 慢病毒包装与感染

每个 10 cm 培养皿接种约 1×106HEK293T 细胞；取6μg目的质粒、4.5 μg psPAX2、1.5 μg pVSV-G 充分混匀于 1 mL HBS 中，静置 5 min；取67 μL CaCl2缓慢滴加到混合液中，充分吹打混匀，静置20 min；将转染体系均匀缓慢地滴加至HEK293T 培养皿中，12 h 内更换培养基；收集病毒，并浓缩至约500 μL；取适量浓缩后的病毒及促感染剂聚凝胺（polybrene，10 μg/mL）滴加至MDA-MB-231 细胞培养基中；24 h 后加入工作浓度为2 μg/mL的嘌呤霉素，筛选带有抗性的细胞。

1.6 PICH敲低效果及细胞增殖检测

按照2 μg/mL的工作浓度将强力霉素（doxy⁃cycline，DOX）加入上述完成筛选的细胞培养基中，72 h 后将细胞接种于96 孔板中（2×103/孔），每组平行3 个复孔，分别于0、1、2、3、4、5 d 用酶联免疫检测仪检测每组细胞的D490nm值；剩余细胞用细胞裂解液裂解，通过Western 印迹检测PICH蛋白的敲低效果。

2 结果

2.1 pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin质粒构建与鉴定

通过检索数据库，合成了2 条不同的shRNA引物，经高温变性、退火后得到引物二聚体。用核酸限制性内切酶EcoRⅠ与AgeⅠ对pLKO.1-teton-Puromycin 载体进行酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳回收目的片段（图1）。将酶切载体与引物二聚体连接后转化、涂板，培养得到单克隆菌落。以单克隆菌落为模板进行菌落PCR，利用核酸凝胶电泳检测PCR 产物（图2），筛选出阳性克隆并测序。测序结果与干涉序列模板的比对结果表明PICH的干涉序列成功插入载体且无碱基突变（图3），pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin 质粒构建成功。将鉴定正确的质粒分别命名为Tet-on-shPI⁃CH-1#、Tet-on-shPICH-2#。

2.2 DOX诱导PICH敲低效果检测

为了得到携带目的质粒的病毒，我们利用磷酸钙转染体系，将重组质粒转染HEK293T 细胞，进行病毒包装。在MDA-MB-231 细胞培养基中滴加适量病毒，感染24 h 后进行抗性筛选，得到嘌呤霉素抗性细胞。用DOX 对筛选得到的细胞进行诱导，96 h 后收集细胞样品，Western 印迹检测PICH的表达效果。结果显示，加入DOX 后，稳定表达Tet-on-shPICH-1#或Tet-on-shPICH-2#的2 组细胞中PICH的表达水平均明显降低，而对照组（Tet-on-shNC）无明显变化（图4）。

2.3 PICH敲低抑制MDA-MB-231细胞增殖

筛选得到的细胞经DOX 诱导48 h 后，计数种在96 孔板中并继续诱导，分别在接种后的第0、1、2、3、4、5 d 用MTT 法检测各孔细胞的D490nm值，评价细胞活力和增殖能力。结果表明，随着PICH表达量的逐步降低，MDA-MB-231的细胞增殖受到显著抑制（图5，P＜0.001）。

图1 pLKO.1-tet-on-shPICH-Puromycin双酶切电泳结果

图2 菌液PCR产物凝胶电泳结果

图3 重组质粒测序结果（片段插入区域33～97bp）

图4 DOX诱导下PICH的表达量检测

图5 MTT法检测PICH敲低对MDA-MB-231细胞增殖的影响（***P＜0.001）

3 讨论

随着社会节奏的加快，女性的工作和生活压力越来越大，乳腺癌患者的数量也在逐年增加，其中三阴乳腺癌以其高转移、易复发、生存率低等特点成为亟待解决的难题[1-3]。因此，针对三阴乳腺癌治疗的新靶标的寻求具有重要意义。

PICH 是细胞有丝分裂过程中姐妹染色单体分离的重要调控分子。细胞分裂后期，它与Plk1结合在着丝粒DNA 上，保证着丝粒DNA 正常断裂及细胞有丝分裂正常进行[14]。研究表明，PICH 在乳腺癌和肾癌中呈高表达，并且高表达PICH的肿瘤患者预后较差[18]，但其中具体的分子机制并不清楚。

本实验室前期研究发现三阴乳腺癌患者的肿瘤组织中PICH 呈高表达，并且PICH 高表达的肿瘤患者预后较差。那么PICH 在三阴乳腺癌中的功能是怎样的？为了解答这一问题，本研究中，我们利用慢病毒感染体系构建可诱导稳定敲低PICH的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231，该细胞系可通过DOX的加入实现PICH 在特定条件下的稳定、可逆性敲低。利用该细胞系，我们初步证明了PICH 能够促进三阴乳腺癌细胞增殖。该细胞系的构建，为我们后续深入探索PICH 在三阴乳腺癌中的功能及其具体的分子机制奠定了重要的实验基础。