报告基因法在生物技术药物活性检测中的应用

牛安娜，苏昕，张晓鹏

1.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，辽宁 沈阳 110016；2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

报告基因法（reporter gene assays，RGA）是通过分子生物学手段，将报告基因整合入待测的生物系统中，继而通过检测报告基因产生的信号，研究特定生物学过程的方法。从广义上讲，利用荧光蛋白观察转染细胞的效率，或者利用抗性基因筛选阳性克隆都属于报告基因法。具体而言，报告基因与目的基因或调控序列相连，通过检测报告基因编码产物的活性，直观反映细胞内基因的转录活性或表达水平[1]。比如将报告基因置于特定启动子调控序列之后，可研究某种条件下启动子的调控或特定基因调控下目的蛋白的表达。作为报告基因，其序列和功能一般均已得到鉴定，最重要的是其表达产物易于被检测。报告基因法的应用非常广泛[2]，常用于信号通路分析、受体功能鉴定、生物大分子相互作用及药物筛选等领域[3]。

1 报告基因法的发展近况

近些年，随着生物技术药物的蓬勃发展，报告基因法逐渐应用于生物药物的生物学活性检测之中。一般是在充分理解药物的分子药理机制的基础上，建立相应的细胞模型，利用报告基因表征待测药物参与的、特定的信号通路的激活，产生生物效应，从而反映药物的生物学活性。

以干扰素为例，早期就有应用报告基因测定干扰素活性的研究[4]。在2015年版《中国药典》中，报告基因法被收录为Ⅰ型干扰素活性测定的标准方法之一[5]。继干扰素后，重组人促红细胞生成素[6]、促胰岛素分泌肽融合蛋白[7]、抗血管内皮生长因子抗体[8]、程序性凋亡受体1 抗体[9]和抗白细胞介素5 抗体[10]等生物制品相继建立了基于报告基因的生物学活性检测方法。基于报告基因的生物学活性测定方法的应用范围正在不断扩大，应用前景广阔。

表1总结了近年来文献报道的基于报告基因法的生物技术药物活性检测方法。可以看到，报告基因法的应用基本涵盖了生物药物的各种类型，包括细胞因子、激素、融合蛋白药物、抗体等。

2 生物学活性检测与报告基因法

生物学活性是药物的关键质量属性之一[23]，是药物有效性的保证。不同的药品具有不同的生物学活性（表1）。生物学活性检测也称为效力测定或生物测定，就是用适当的方法，定性或定量地反映生物学活性。而为了药物评价的需要，一般要采用定量方法得到药物产生特定生物学效应的具体量值。

从表1可以看到，利用报告基因法进行药物活性测定基本都是在活细胞体系上通过基因工程构建报告细胞系来建立的。基于细胞的活性检测方法有其独特优势：相较于生化反应，它更能体现药物的生物学活性[24]；而相对于动物实验，细胞实验又表现出更好的重复性、易操作性和更低的人力、物力、时间成本。

报告基因法与基于细胞水平的活性测定相得益彰。药物诱导细胞产生生物学应答，这个过程中涉及特定信号通路的活化和传导。而报告基因法则可以通过报告基因信号的检测，快速表征相关信号的激活，从而反映药物相应的生物学活性。

报告基因法应用于生物制品活性检测有如下优势。一是快速。表1中各个生物制品相关的报告基因法基本可在1 d 内完成检测，远远优于传统方法。以干扰素为例[4]，传统的噬斑法要从病毒感染到观察到细胞病变，至少需要2 d。从这个角度而言，快速的报告基因法不仅能够极大地降低时间成本，最重要的是提高了药物研发的效率。二是方法变异度小。以表1中抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体的生物学活性检测为例，报告基因法的精密度和准确性都较高（变异系数CV 均小于10%），而传统的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖法精密度和准确性的CV 都小于15%[8]。较小的变异度意味着测定结果更为真实、可靠。三是能够反映药品生物学活性的分子机制。中国药典和美国药典均指出，药物活性测定的方法应尽可能反映或模拟药物预期的作用机制[5,25]，若测定方法不能反映功能相关作用机制，则需要证明其他测定方法与生物活性测定方法相关。一个成功的报告基因活性测定方法，正是利用了药品活性相关的信号通路，从而能够直观地反映药物的作用机制。

表1 报告基因检测在生物药物活性检测领域的应用

3 报告基因法的要素

用于生物学活性检测的报告基因法在建立之初主要考虑3 个要素：检测用细胞、待测的报告基因，以及涉及的信号通路的选择。

3.1 检测用细胞的选择

为了检测方法的稳定性，检测所用细胞一般选用能够稳定传代的细胞系或细胞株，以方便报告基因的转基因操作和细胞的克隆化。由原代细胞或不稳定的细胞系构建的报告细胞，无法保证本次检测时细胞的状态一致，也就无法准确、定量地反映待测药品的质量。同时，检测用细胞还要尽量考虑是待测药物的靶细胞，药物刺激与靶细胞产生的变化相关，这样能更加真实地反映待测药物的活性，也便于与其他方法进行比较。例如，在测定抗白细胞介素6（IL-6）/IL-6 受体（IL-6R）抗体药物的生物学活性研究中，作者选用IL-6 依赖的DS-1 细胞作为测定的靶细胞[21]。DS-1 是 IL-6 依赖的 B 淋巴细胞，只能在 IL-6 存在的条件下存活。靶表面含IL-6R，能与IL-6 结合激活下游信号通路，在机体免疫中发挥重要作用。抗IL-6/IL-6R 抗体药物可阻断IL-6/IL-6R 相互作用，用于治疗免疫相关疾病。选用DS-1 作为靶细胞更能真实地模拟抗IL-6/IL-6R 抗体药物作用的机制。

3.2 报告基因的选择

报告基因是编码基因，其编码产物可以是某些蛋白或酶类[26]。迄今发展的报告基因种类很多，在不同领域的应用也非常广泛。选择报告基因的原则，一是要考虑报告基因的表达是否对宿主细胞有影响，是否有内源性活性的干扰[27]；二是要考虑报告基因检测信号的类型和相应的检测方法是否成熟。

常用的报告基因有CAT（氯霉素乙酰基转移酶）、SEAP（分泌型碱性磷酸酶）、GFP（绿色荧光蛋白）、β-半乳糖苷酶、GUS（葡萄糖醛酸酶）等[28]。但如表1所示，生物制品活性测定中多采用萤光素酶基因作为报告基因。相对于其他报告基因，萤光素酶具有诸多优势：检测灵敏度高，如萤火虫萤光素酶的检测灵敏度可达10-20mol[29]，灵敏度约为CAT的100 倍，信号半衰期可维持数小时；检测范围宽，可达7～8 个数量级[30]；与β半乳糖苷酶相比，哺乳动物细胞无内源性萤光素酶活性[31]；有多种商品化萤光素酶检测系统可选。

3.3 细胞信号通路的选择

药物作用于细胞，细胞内会产生多种效应，最终表现可能是促进细胞增殖，或抑制细胞增殖、产生细胞毒效应或抗病毒效应等[32]。在分子层面上，这些表型的背后势必涉及多条信号通路的协同、竞争和整合。因此，应尽量选择与最终细胞表型相关、最能反映药品药理性质的通路。这就要求对药品的作用机制有全面的理解。如若不然，选择其他通路虽然也能反映药物活性，但是违背了药典的“应尽可能反映或模拟产品预期的作用机制”的原则。例如，在采用萤光素酶报告基因法筛选5-羟色胺（5-HT）受体药物介导信号通路的研究中[33]，作者详细比较了药物刺激后 3 种相关信号通路 SRE、CRE、NAFT 引起细胞效应的变化，分别得到了不同的信噪比和半数有效量。结果显示，相比较于NFAT-Luc，CRE-Luc与SRE-Luc 方法的信噪比较高。但由于SRE-Luc易受细胞培养基中血清的干扰而影响实验结果，而CRE-Luc 不受血清影响，更能反映受体激活状态，因此最终选择CRE-Luc 信号通路用于筛选不同的5-HT 受体激动剂和抑制剂。

4 报告基因法在生物药物研发中的应用

基于报告基因法检测药品生物学活性，除了可用于最终产品质量的检定和放行[34]，也可用于生物制药的各个阶段。

可用于早期候选分子的设计与筛选。由于报告基因法简单快速，可以构建相应的高通量筛选方法[35]。如高通量筛选γ-珠蛋白基因的激活剂，利用萤光素酶双报告基因法，从约15 000 个化合物的库中筛选得到1072 个具有生物学活性的化合物，在此过程中报告基因的检测用时约2 h，极大地提高了药物的筛选效率[36]。

可用于生物制品生产工艺的优化。在生产工艺建立和优化的过程中，经常需要摸索大量实验条件，对不同条件下获得的样品进行检测，随后根据检测结果进一步优化实验条件。这一过程中生物学活性检测往往是限速步骤。报告基因法的引入可以很好地解决这个问题，而且适用于实验设计研究方法[37]。

更为重要的是，报告基因法灵敏度高，可以检测到因生产工艺变化带来的对产品生物学活性的微小影响。不同生产工艺会影响蛋白翻译后修饰[38]，进而造成产品的生物学活性变化。这些变化一般很小，常规活性检测方法由于方法本身变异度较大，会掩盖掉这些微小差异。因此，在本阶段采用报告基因法进行活性检测，可以使生产工艺的优化和质量研究更加有效。

5 结语

生物学活性测定方法多种多样，发展迅速，而报告基因检测方法可通过报告基因直观地反应药物的生物学活性及更深层的药物作用机理，目前已应用到许多药物的生物学活性检测中。近年来报告基因法也应用于免疫和肿瘤药物领域，如一些肿瘤相关的免疫抑制检查点药物活性检测也应用报告基因法反映药物的活性和作用机制。由于报告基因法具有快速、灵敏及易于高通量的特点，利用其检测生物制品的生物学活性，可以应用于从靶点筛选、生产工艺验证到终产品的质量控制等药物研究的各个阶段，加速药物的研发。报告基因法还可以反映药物的分子机制，从而更加准确地表征其生物学活性。在我国生物制品研究快速发展的今天，报告基因法的应用有利于生物制品质量体系的建立和规范，促进产业发展。