贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相突变体的克隆与鉴定

何泽民，孙志会，于永慧，罗声栋，王益清，王景林，姜永强，宋立华

1.病原微生物生物安全国家重点实验室，军事科学院军事医学研究院 微生物流行病研究所，北京100071；2.解放军总医院第五医学中心 临床研究管理中心，北京 100039

贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）俗称 Q 热立克次体，为革兰阴性专性细胞内寄生菌。贝氏柯克斯体主要通过气溶胶传播，引起人类Q 热（que⁃ry fever，不明热），通常表现为流感样症状，感染剂量可低至1 个菌体[1]。九里（Nine Mile）株是贝氏柯克斯体参考菌株，于1935年分离自美国蒙大拿州的一只安氏革蜱[2]。世界各地的实验室用不同培养方法对此参考菌进行了长期传代。传统的贝氏柯克斯体培养方法包括感染动物、鸡胚培养和细胞培养，直到2009年美国落基山实验室发明了贝氏柯克斯体无细胞培养方法[3-4]。

在鸡胚或细胞体外培养时，不同贝氏柯克斯体分离株均会发生不可逆的相变异。九里株的典型相变异是从强毒的Ⅰ相变异为弱毒的Crazy相[5]或无毒的Ⅱ相[6-7]。九里株的Ⅰ相、Crazy 相、Ⅱ相菌分别表达全长脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、含部分 O 抗原的 LPS、完全缺失 O 抗原的LPS[8]。与九里株Ⅰ相菌（RSA 493 克隆）的基因组相比，九里株Ⅱ相菌（RSA 439 克隆）基因组的主要变化是有25 997 bp的删除区，对应20 个基因（CBU_0679～CBU_0698）的缺失[9-10]，而 Crazy 相的基因组在Ⅱ相菌删除区基础上有更多的碱基缺失[8,10]。显然九里株的删除区与Ⅱ相变异无明显关联。长期以来，九里株及其他贝氏柯克斯体分离株的相变异遗传学机制不清楚。

九里株Ⅱ相菌的培养特征等与九里株Ⅰ相菌高度相似[11]，且致病力低，可以在生物安全Ⅱ级实验室操作[12]，在贝氏柯克斯体研究中被广泛应用。长期以来，研究人员用九里株Ⅱ相菌（RSA 439）开展研究，但以Ⅰ相菌（RSA 493）基因组序列为参考[14]，九里株Ⅱ相菌的基因组细微变异缺乏报道。2017年美国科学家Millar 对九里株Ⅱ相菌（RSA 439，Clone 4）进行了测序，在删除区基础上鉴定了更多的单核苷酸多态性位点（single nucleotide polymorphisms，SNP）变 异[12]。 2018年Beare 等阐明了 RSA 439的相变异与 CBU_0533 变异有关[8]。我们用半固体平板克隆方法对我室保存的九里株Ⅱ相菌株进行分离和全基因组测序分析，有助于理解贝氏柯克斯体的体外适应性变异，也对今后采用遗传背景均一的贝氏柯克斯体克隆开展相关基础研究有参考意义。

1 材料与方法

1.1 九里株Ⅱ相菌的克隆分离与基因组提取

贝氏柯克斯体九里株Ⅱ相菌株为本室保存。利用国外已发表的平板克隆方法[4]，随机选择单克隆连续克隆2 次，得到CB01 克隆株，将CB01 接种到 ACCM-2 中，在 37℃、2.5% O2、5%CO2的环境中培养，培养 7 d 后 4℃、12 000 r/min离心15 min 收集菌体沉淀，用蛋白酶K 消化-酚氯仿抽提法纯化基因组DNA，-20℃保存。

1.2 测序

对提取的基因组DNA 用Illumina Hiseq 2500和PacBio RSⅡ测序系统分别做二代和三代测序，由北京贝瑞和康生物技术有限公司完成。

1.2.1 PacBio 数据产出流程 利用Nanodrop/凝胶电泳技术检测样品，样品合格后采用标准的PacBio 建库流程构建文库，建好的文库按PacBio标准文库QC 流程进行质控，按PacBio 标准上级流程进行。

1.2.2 Illumina 数据产出流程 利用Nanodrop 测D260nm/D280nm和凝胶电泳技术检测样品，样品合格后采用标准的Illumina 建库流程构建文库，建好的文库采用AB 公司的stepONE plus QPCR 仪进行质检，当文库检测为单峰，且浓度高于3 nmol/L，体积大于25 μL 判定为合格，按照Illumina 标准Cluster 生成、Pooling 和定量方法进行样本文库混合，并制备Cluster。

1.2.3 测序反应 由 Bluepippin 系统（Sage Sci⁃ence 公司）生成 20 kb SMRTbell 库，利用 PacBio RSⅡ系统进行单分子实时读长测序。

1.3 测序结果分析

对三代测序的结果进行拼接，然后用二代测序结果清洗三代，得到全基因组序列。在Patric（https://www.patricbrc.org/）上对全基因进行整体分析。

1.4 基因组比对

从NCBI下载RSA 439和RSA 493基因组序列及注释（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ge⁃nomes/543），用Snippy软件（https://github.com/tseemann/snippy）将CB01序列分别与RSA 493和RSA 439的基因组序列进行比较分析，找出SNP并对差异基因功能进行注释。在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上分别将CB01 基因组与RSA 439 基因组和RSA 493 基因组进行比较，找到大片段差异。

2 结果

2.1 CB01全基因组测序结果

贝氏柯克斯体是专性胞内寄生菌，但其基因组富含插入序列[14]。以插入序列IS1111 为例，该序列编码转座酶，其拷贝数高达56 个。由于贝氏柯克斯体基因组中重复序列多，结构复杂，普及应用的二代测序技术无法获得完整基因组序列。为了解CB01的完整基因组结构，首先利用PacBio 三代测序技术进行测序并获得完整的基因组框架。意外的是，我们发现该测序技术在分析贝氏柯克斯体序列中的重复碱基时易发生错误的单碱基缺失。因此，又采用二代测序技术对三代测序结果进行单碱基缺失校正。校正后的CB01 基因组全长2.024 Mb，GC 含量为42.68%，包含1 个1.987 Mb的环状染色体和1 个37.321 kb的质粒。染色体包含2213 个蛋白编码区（CDS）、87 个重复区域、41 个 tRNA 编码区和 3 个rRNA 编码区；质粒包含54 个CDS。环状染色体基因组模式如图1所示。

2.2 与九里株Ⅰ相菌RSA 493基因组的比较分析

与RSA 493的基因组进行比对，CB01 染色体上存在23 个 SNP，包括14 个碱基替换（表1）、7 个碱基缺失（表2）和1 个位于基因间区的碱基插入。CBU_0533 基因中的单碱基缺失是九里株发生Ⅱ相变异并缺失O 抗原的遗传学原因[9]。因此测序结果在遗传学上证实了CB01 为Ⅱ相菌克隆。另外，质粒上存在1 个同义突变（表1）。

图1 贝氏柯克斯体九里株CB01克隆的染色体模式图

表1 碱基替换统计表

表2 缺失碱基统计表

表3 碱基替换统计表

表4 碱基缺失统计表

2.3 与九里株Ⅱ相菌RSA 439基因组的比较分析

与RSA 439的基因组进行比对，CB01 存在6个SNP，包括4 个碱基替换（表3）和2 个碱基缺失（表4）。CB01的质粒与Ⅰ相 RSA 493 相比有 1 个同义SNP，与Ⅱ相菌RSA 439 相比有2 个非同义SNP 差异和1 个同义SNP。测序结果说明CB01的适应性生长更大的可能性与染色体变异有关，而国外Ⅱ相菌RSA 439的体外适应性生长可能同时与染色体和质粒变异相关。

2.4 大片段差异

与九里株Ⅰ相菌RSA 493的基因组相比，CB01 基因组有一段删除序列，大小为25 997 bp，对应 RSA 493 基因组的 620 667～646 663 碱基，导致 CBU_0679～CBU_0698 基因缺失。CB01 基因组上还存在5 个重复序列，大小分别为1562、4998、4117、3351 和 3831 bp，共包含 20 个基因。与九里株Ⅱ相菌RSA 439 相比，CB01 同样多出这5 个重复序列。

3 讨论

贝氏柯克斯体九里株自1935年被首次培养后在国际上广泛流传，是贝氏柯克斯体研究用参考菌株。我国的九里株引自前苏联。由于培养困难，易发生交叉污染等原因，有必要对研究用菌株进行遗传学鉴定。我们利用高通量测序技术完成了贝氏柯克斯体九里株CB01 克隆的完整基因组测序，发现CB01的菌株甄别位点与九里株Ⅰ相完全相同，可鉴定CB01 为九里株克隆。与九里株Ⅰ相RSA 493 克隆相比，CB01 存在删除区变异和CBU_0533 基因变异，这些变异与九里株Ⅱ相菌RSA 439 克隆的变异完全相同，这可以将CB01 进一步鉴定为Ⅱ相菌。九里株Ⅱ相菌CB01 克隆可用做国内贝氏柯克斯体研究用参考菌株。

与九里株Ⅱ相菌RSA 439 相比，CB01 至少有6 个SNP 差异和5 个重复序列差异，其中3 个SNP位于质粒。可以明确CB01 是不同的九里株Ⅱ相克隆。贝氏柯克斯体菌的体外适应性变异机制还缺乏研究，不同的适应性变异可能与不同的培养体系有关。我们的测序结果可说明九里株体外适应性变异的多样性。国外已对贝氏柯克斯体脂多糖O 抗原的合成机制进行了较详细的遗传学分析。考虑到其他分离株的相变机制还不清楚，以及存在LPS 合成基因之外的适应性变异，本研究也提示有必要深入探讨贝氏柯克斯体Ⅰ相菌的相变异和适应性变异机制。