SD 大鼠胸腹主动脉平滑肌细胞的原代培养及鉴定

马华根，林华城，刘昭德，唐元瑜

（1 福建中医药大学中医学院，2 福建中医药大学第二临床医学院，3 福建中医药大学中西医结合学院，4 福建中医药大学中医学院中医基础理论教研室，福州 350122）

平滑肌细胞，按其分布及特点，可分为血管平滑肌细胞和内脏平滑肌细胞。其中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）位于血管壁中膜，在维持管壁的完整性和调节血管的舒缩功能等方面起着重要作用[1]。VSMCs 是研究肺心病、高血压病、心脑血管动脉粥样硬化疾病、糖尿病血管病变，以及开展血管再生组织工程研究的重要载体和工具细胞。目前该细胞的原代培养方法，主要包括组织块法和化学酶消化法：前者操作简单，实验成本低，但细胞培养周期长，且易混入较多杂细胞；后者虽然获得的目的细胞纯度较高，但操作过程繁琐，细胞生长缓慢，所需试剂价格昂贵。课题组参考日本东京大学学者Kobayashi M 建立的方法[2]，并稍加改进。通过预实验，在反复权衡上述两种培养方法各自的利弊后，将二者结合，成功建立了一种高效、实用的VSMCs 原代培养方法。

材料和方法

1 实验动物

6 ～8 周龄SD 大鼠2 只，雌雄不限，购自福建医科大学实验动物中心，动物质量合格证号为SCXK（闽）2016-0002。

2 主要试剂

胎牛血清（Gibco 公司，P161102ES），M199培养基（Gibco 公司，1839543），0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA 混合消化酶液（南京凯基生物公司，20170602），Trition X-100（Solarbio 公司，T8200），Ⅱ型胶原酶（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，461699），猪胰弹性蛋白酶（源叶生物公司，Y27J10J91591），α平滑肌肌动蛋白单克隆抗体（万类生物科技有限责任公司，106280002），羊抗兔IgG—免疫组织化学试剂盒SABC 即用型（12F07A）、4%多聚甲醛（12D08A68）、DAB 显色剂（12F08A22）均购自武汉博士德生物公司。

3 主要仪器

美国Thermo CO2恒温培养箱，德国LEICA- DFC295 倒置生物显微镜，Airtech 超净工作台，湘仪TDZ4A-WS 低速离心机。

4 血管平滑肌细胞原代培养

在动物实验中心，将受试大鼠颈椎脱臼处死，固定于解剖台上，常规消毒后，剪开胸腹腔，充分暴露胸腹主动脉。从胸主动脉弓开始，小心剥离主动脉至骼总动脉分支处，用中号动脉夹夹闭两端，剪取胸腹主动脉约4cm，迅速置于无菌离心管内，带回细胞室。在超净台内，用眼科弯镊将主动脉筋膜、脂肪及外膜依次彻底剥离后，用预冷的磷酸盐缓冲液漂洗2～3 遍，以除去血凝块。在无菌玻璃皿中将主动脉血管内膜外翻，加入预热的2mg/ml Ⅱ型胶原酶/弹性蛋白酶混合消化液6ml，37℃水浴振摇消化0.5h 后，用锋利的无菌手术刀片来回刮除内膜2～3 遍，继续消化45min，离心，弃混合酶液。用虹膜剪将主动脉剪碎至米粒大小，加入含25%胎牛血清的M199 完全培养液4ml，吹打均匀，吸入培养瓶内，轻缓作十字形晃动，使组织块分布均匀，旋松瓶盖，静置于CO2恒温培养箱中，3～4d 后半量更换新鲜培养液。

5 血管平滑肌细胞传代培养

待细胞进入对数生长期，吸弃旧培养基，用37℃预热的PBS 液漂洗2 遍，然后加入4ml 0.25%胰蛋白酶／0.02%EDTA 室温下消化2～3min，并轻微地间断性敲击振摇培养瓶底部，以促进细胞脱落。待大部分细胞圆缩时，加入4ml 完全培养基终止消化，离心，弃上清液，将细胞沉淀与6ml 培养液吹打混匀后，以1:2 的传代比例接种，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

6 形态学观察

将接种有原代和第一代传代VSMCs 的培养瓶置于倒置生物显微镜下观察细胞的形态、贴壁、密度及融合度等生长情况，并拍照记录。

7 α 平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色检测

将原代大鼠VSMCs 消化成单细胞悬液后，接种于培养皿中，待其贴壁生长，融合度接近80%时进行鉴定。用PBS 轻缓漂洗5min×3 次，滤纸吸干残存液；滴加预冷的4%多聚甲醛，覆盖细胞表面，常温固定15min；弃固定液，PBS 轻缓漂洗5min×3次，滴加0.3%Triton X-100，打孔透膜15min；倾倒透膜液，PBS 漂洗5min×3 次，滴加5%牛血清白蛋白，室温封闭20min；弃封闭液，滴加1:250 α 平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，将封口膜小心覆盖于抗体液及细胞表面，置于湿盒中4℃孵育过夜；复温，弃一抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加生物素化的羊抗兔IgG 抗体，37℃孵育30min；弃二抗，PBS 漂洗5min×3 次，滴加SABC，37℃孵育30min；PBS 漂洗5min×3 次，DAB 室温显色1～2min，漂洗后，于倒置显微镜下观察，并拍照记录。

结 果

倒置显微镜下观察可见：接种于培养瓶中的血管组织块培养48h 开始贴壁，72h 后细胞以组织块为中心，向外迁移，“岛屿状”细胞团初步形成（图A，图B）。96h 后原代细胞集落逐渐融合，铺满瓶底，呈现典型的“峰-谷”样错落生长（图 C）。第一代传代细胞形态基本保持不变，镜下为三角形或星形（图D，图E）。免疫细胞化学SABC 法染色显示，99%以上的第一代传代细胞呈α 平滑肌肌动蛋白免疫反应阳性。免疫反应阳性产物定位于细胞质，细胞核呈阴性（图F）。

图1 原代大鼠胸腹主动脉平滑肌细胞培养。A 和B，72h 原代岛屿状细胞生长晕集落初形成；C，96h 原代细胞融合呈典型“峰-谷样”错落生长；D 和E，第一代传代细胞形态保持不变，呈三角形或星形；F，第一代传代细胞α 平滑肌肌动蛋白相关抗原免疫细胞化学染色表达阳性；比例尺：A，400μm；B—D，200μm；E，100μm；F，50μm Fig.1 Primary culture of rat thoracic and abdominal vascular smooth muscle cells. A and B, after 72h island-like primary cell outgrowth colonies formed preliminarily； C, after 96h the fusion of primary cells showed a typical “peak-valley-like”staggered growth； D and E, the morphology of passage 1 cells remained unchanged , which is triangular or astral； F, the passage 1 cells showed positive expression of α smooth muscle actin-associated antigen by immunocytochemistry； scale bar: 400μm in A, 200μm in B to D, 100μm in E and 50μm in F

讨 论

有研究表明，异常增生的VSMCs 能大量合成胶原纤维、弹力纤维以及酸性粘多糖等基质，而这些基质是组成血管斑块的重要成分。VSMCs 的异常增生和迁移是动脉粥样硬化斑块形成过程中的关键因素之一，是导致高血压病、动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病血管病变、肿瘤转移，以及血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病发生的重要细胞病理学基础[3,4]。原代VSMCs 培养方法的成功建立，对于揭示相关疾病的病理变化机制有重要的学术奠基意义。

VSMCs 的原代培养方法，以酶消化法最为常用，而消化酶种类的选择和运用，需结合该细胞所在的血管组织结构特点而定，这是平滑肌细胞能否体外培养成功的关键。主动脉为内壁光滑、富有弹性的空腔样器官，其管壁包括内膜、中膜及外膜3 层结构：内膜由内皮、内皮下层和内弹性膜组成；中膜由平滑肌及丰富的弹性纤维、胶原纤维构成；外膜则为结缔组织，与周围的肌肉、脂肪相连。结合主动脉这一特殊的解剖结构，我们有针对性地选择了粗制Ⅱ型胶原酶与弹性蛋白酶组成复合酶以加速血管中膜弹性纤维蛋白的溶解；同时还采用消化底物体积10 倍的酶液量充分裂解主动脉血管段，这与国内学者使用单一的胶原酶[5,6]或胶原酶/胰蛋白酶混合酶[7,8]的消化效果相比，得到的细胞团块更大，数量更多，细胞活性也更好，且能节约大量时间，最终提高了实验效率。在消化结束后，将未消化完全的细小组织块也接种到培养瓶中，并静置培养3～4d，以增加细胞接种密度，缩短细胞生长的潜伏期，也有利于细胞提早进入对数生长期，从而加快细胞的分裂增殖速度。

此外，在原代培养过程中，VSMCs 的纯化也是我们重视的问题之一。本实验通过物理剔除法剥离外膜，以避免成纤维细胞的污染；同时通过锐利的手术刀片仔细刮除内膜，避免内皮细胞的污染；并以传代为手段，利用目的细胞的群体优势，进一步纯化VSMCs。实验结果表明：细胞传代融合后，在形态学上呈现出典型的“峰-谷”状交错生长，即细胞密集处与稀疏处相互交错，“峰”为多层细胞丘，“谷”为稀疏排列的单层细胞[9]；同时结合α 平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学染色检测结果，阳性细胞率高达99%以上，据此可进一步证明所培养的目的细胞为纯度较高的VSMCs。

总之，本实验将酶消化法与组织块法结合，成功培养出了大鼠胸腹VSMCs，并针对该细胞特有的生物抗原α 平滑肌肌动蛋白，应用免疫细胞化学染色方法，结合细胞形态学观察，对所培养的目的细胞进行了鉴定。该方法简便高效，实验成本低，成功率高，值得推广。