犬尿氨酸信号通路的组成成分及对脊髓继发性损伤的影响

钟佳师，郭祥，刘亦恒，符策岗

（1 海南省临高县人民医院外四科（骨科），临高 571800；2 中南大学湘雅医学院附属海口医院骨科中心，海口570208；3 上海市第六人民医院-海口骨科与糖尿病医院骨科，海口 570000）

当中枢神经系统（central nervous system, CNS）损伤时，持续的神经炎症反应会加重继发性损伤。此外，损伤局部活化的免疫细胞(Th1)大量会分泌的干扰素-γ（interferon-γ, INF-γ）或感染相关的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），这将诱导具有神经保护作用的M2 小胶质细胞/浸润性巨噬细胞转变为具有神经毒性作用的M1 表型并进一步激活犬尿氨酸信号通路（kynurenine pathway, KP）并促进神经毒性物质喹啉酸（quinolinic acid, QUIN）的分泌[1,2]。QUIN能促进多种神经毒性反应，包括：显著的激活N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体、直接与游离铁离子相互作用形成毒性复合物、引起神经元Ga2+内流、一氧化碳合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）活化、增加一氧化碳(NO)的产生、促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）等等。这些神经毒性反应将破坏线粒体膜的稳定性、激活ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)、并引起烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）过度消耗等等一系列不良事件，这些事件会引起恶性循环，比如线粒体功能障碍将促使KP 偏向犬尿氨酸3-羟化酶（kynurenine 3-monooxygenase, KMO）分支而产生更多的QUIN，最终导致神经元细胞死亡[3,4]。

1 犬尿氨酸信号通路是色氨酸代谢的主要途径

KP 负责95%的色氨酸降解，QUIN 和3-羟基犬尿氨酸（3-hydroxykynurenine, 3-OH-KYN, 3-HK）是主要的代谢产物（图1）[3]。色氨酸在体内主要用于合成五羟色胺和褪黑素，当色氨酸需要分解代谢时，KP 将被激活。主要信号通路是：色氨酸在色氨酸双加氧酶和吲哚胺2,3-二氧酶的催化下生成犬尿氨酸，紧接着在犬尿氨酸3-羟化酶的帮助下生成3-羟基犬尿氨酸，接下来又在犬尿氨酸酶的帮助下生成3-羟基氨基苯甲酸，然后在3-羟基氨基苯甲酸加氧酶的催化下生成2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛，最终生成QUIN（具有促炎作用）。其他信号分支包括：犬尿氨酸在犬尿氨酸转氨酶的帮助下生成犬尿稀酸（kynurenic acid, KYNA）(具有神经保护作用)、3-羟基犬尿氨酸在犬尿氨酸转氨酶的帮助下生成黄尿酸、犬尿氨酸在犬尿氨酸酶的帮助下先生产邻氨基苯甲酸后再形成3-羟基氨基苯甲酸、2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛在2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脱羧酶的催化下生产2-吡啶甲酸等等[5]。其中值得一提的是，QUIN 是内源NMDA 受体激动剂，而KYNA 则是内源性NMDA 受体拮抗剂，这两个代谢分支彼此互相竞争、互相制约[2]。

图1 犬尿氨酸通路示意图。ACMS，-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛；TDO，色氨酸双加氧酶；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KAT，犬尿氨酸转氨酶；KYNU，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羟化酶；3-HAO，3-羟基氨基苯甲酸加氧酶；ACMSD，2-氨基-3-羧基甲酸甲酯半醛脱羧酶；QPRT，喹啉酸磷酸核糖基转移酶Fig. 1 Schematic diagram of the kynurenine pathway. ACMS, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde； TDO, tryptophan dioxygenase； IDO, indoleamine 2,3-Dioygenase； KAT, kynurenine aminotransferase； KYNU, kynureninase； KMO, kynurenine 3-monooxygenase； 3-HAO, 3-hydroxyanthranilic acid oxygenase； ACMSD, 2-amino-3-carboxymuconate semialdehyde decarboxylase； QPRT, quinolinic acid phosphoribosyl transferase

如果KP 过度活化会引起QUIN 的过度分泌，加剧神经毒性和神经损伤[6]。此外，KP 的另一种主要代谢产物3-HK 及其下游产物3-羟基氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid, 3-HAA）一开始被认为是神经毒性反应的代谢产物，现在发现它在氧化还原反应中也发挥重要的作用。尽管3-HAA 被证实能抑制胶质细胞分泌细胞因子和炎症趋化因子而发挥抗炎的作用，但是它另一方面又增加氧化还原应激反应并诱导神经细胞死亡[7]。

2 脊髓损伤时巨噬细胞和犬尿氨酸信号通路的变化

SCI 预后差与损伤后具有促进增殖和修复等神经保护作用的M2 型小神经胶质细胞/巨噬细胞（主要是巨噬细胞）转变为具有细胞毒性作用的M1型密切相关[8]。M1 型巨噬细胞能产生大量的促炎因子、活化 KMO 并激活KP，产生大量的QUIN 引发一系列神经毒性反应，最终导致细胞死亡和严重的神经后遗症（图2）[1]。

TNF-α、IL-1β、INF-γ、NO 和超氧阴离子（O2-）等细胞因子在促使M2 向M1 转型中发挥重要的作用，他们都是活化KP （NO 和O2-）或者KP 下KMO分支的产物（TNF-α、IL-1β 和INF-γ）。研究证实，促使细胞因子谱转向具有神经保护作用的M2 型，对减少SCI 继发性损伤，提高Basso Mouse Scale（BMS）评分至关重要[1,2]。需要注意的是，活化的M1 型巨噬细胞在SCI 分泌的QUIN 是未活化状态下的204 倍，因此，巨噬细胞、KP、QUIN 以及神经毒作用之间的联系在近年受到了人们的广泛关注[9]。

图2 脊髓损伤中巨噬细胞、犬尿氨酸信号通路、QUIN 和神经毒作用的关系。TRP，色氨酸；IDO，吲哚胺2,3-二氧酶；KYN，犬尿氨酸酶；KMO，犬尿氨酸3-羟化酶；3-HK，3-羟基犬尿氨酸；KYNU，犬尿氨酸酶；3-HAA，3-羟基2 氨基苯甲酸；3-HAO，3-羟基氨基苯甲酸加氧酶；QUIN，喹啉酸；TNF-α，肿瘤坏死因子α；INF-γ，干扰素γ；IL-1β, 白细胞介素1β；ROS，活性氧Fig. 2 Relationship between macrophage, kynurenine pathway, QUIN and neurotoxicity in the spinal cord injury. TRP, tryptophan； IDO, indoleamine 2, 3-dioygenase； KYN, kynurenin； KMO, kynurenine 3-monooxygenase； 3-HK, 3-hydroxykynurenine； KYNU, kynureninase； 3-HAA, 3-hydroxyanthranilic acid； 3-HAO, 3-hydroxyanthranilic acid oxygenase； QUIN, quinolinic acid； TNF-α, tumor necrosis factor-α； INF-γ, interferon-γ； IL-1β, interleukin-1β； ROS, reactive oxygen species

3 急性脊髓损伤中血红素氧化酶1 与犬尿氨酸信号通路和核因子红细胞相关因子2 信号通路的关系

早期就发现活化的中性粒细胞能大量分泌HO-1，且HO-1 抑制剂能延迟SCI 后运动功能的恢复，预示着HO-1 在SCI 中发挥抗氧化的保护作用[10,11]。Nrf-2-抗氧化反应元件（anti-oxidant response, ARE）是HO-1 的主要调节因子，静息状态下Nrf-2 待在细胞质内与Keap1 蛋白结合处于失活状态，当细胞受到外界刺激或内源性损伤时，可以刺激Nrf-2 表达并移位到细胞核内与ARE 反应原件结合并诱导HO-1 的表达。有趣的是，KP 的代谢产物QUIN 和3-HK 都能激活Nrf-2 向细胞核转移，并激发抗氧化作用，这无疑与之前描述中QUIN 和3-HK的神经毒性作用背道而驰[12]。进一步的研究，通过将QUIN 处理的大鼠纹状体切片后发现，Nrf-2 的细胞核转移发生在1h 后，减少脂肪过氧化作用是在3h后[12]。因此我们有理由相信，QUIN 诱导的Nrf-2 细胞核转移并不是直接的，我们更倾向于相信这是对QUIN 诱导ROS 后的一种补偿机制或者负反馈，是抗氧化防御系统的一部分。

4 犬尿氨酸信号通路与SCI 治疗

研究发现，SCI 发生5 天后，QUIN 在损伤局部升高超过10 倍，KP 的起始酶（也是限速酶）吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO-1）升高2 倍，且值得一提的是，周围未受伤的部位没有发现这种变化[1]。在SCI 发生后，通过注射4-氯-3-羟基氰氨基甲酸酯（4-chloro-3-hydroxyanthranilate, 4-Cl-3-HAA）（一种3-羟基氨基苯甲酸加氧酶抑制剂）能有效阻断3-HAA 转换成QUIN，最终显著降低神经功能的缺失[13,14]。但要取得这样良好的结果，必须在SCI 局部白质的完整的条件下注射4-Cl-3-HAA才能实现[14]。进一步的研究发现，单剂量的4-Cl-3-HAA 用于治疗SCI 并不能达到上述相同的肢体感觉运动的恢复，这表明4-Cl-3-HAA 的疗效得益于长期的使用以减少QUIN 在局部的聚集，而不是单纯的早期抗氧化作用[15]。但是，4-Cl-3-HAA 并不能显著提高具有神经保护作用KYNA 的表达，研究发现，定向微量注射KYNA 能显著改善SCI 后肢体功能的恢复，主要是因为KYNA 的衍生物，葡萄糖胺，能促进SCI 后神经功能的恢复，减少功能缺失[16]。总而言之，如果能将KP 从产生QUIN 的KMO 分支转向生成KYNA 的方向，这可能对SCI 的治疗提供不可小视的帮助。

随着研究的不断发展，表观遗传学在近年受到人们的广泛关注和青睐。KP 和SCI 的最新研究致力于通过基因调控SCI 中KAT-α（一种介导KYNA 合成的KP 相关酶）的表达，达到促进SCI 功能恢复的目的[17]。这主要得益于KYNA 表达增加，能拮抗NMDA 受体，从而抑制神经元Ga2+内流和 nNOS 活化等一系列神经毒性作用，这同时也会减少KMO 途径的活化，降低QUIN 的生成。此外，氯胺酮及其他的NMDA 受体拮抗剂能显著改善损伤引起的神经性疼痛[18]。在一项大鼠研究中发现，在SCI 发生7d 后，坐骨神经长期受到压迫而引发的神经性疼痛时，IDO2、KMO 和3-HAO 的mRNA 表达显著升高。反复的使用KMO 抑制剂（UPF-648 和Ro 61-8048）能减少过敏反应并减少神经性疼痛，其目的也是将KP 更多地转向了NMDA 受体拮抗剂KYNA的方向[19,20]。但是目前KP 用于SCI 治疗的研究相对匮乏，大部分研究都集中于KP 用于大脑神经退行性变的治疗，因此仍需进一步的实验来弥补KP 用于治疗SCI 的空白，为最终用于临床打下坚实的实验基础。

5 小结

近年来KP 受到人们广泛的关注，在多种疾病中被深入研究，包括重度抑郁、自杀倾向、孤独症、精神分类、帕金森和阿尔茨海默病等，并证实KP 在神经退行性疾病中扮演重要角色，这给KP 与SCI 的研究奠定了良好的实验基础[21-24]。这些研究阐明的一些现象，也解释了一些问题，同时也留给人们一些思考。针对KP 的研究证实，KMO 抑制剂对SCI的治疗具有重要的价值，它不仅减少了长期炎症引起的病理生理学影响，还缓解患者的情绪，且改善SCI 引发的神经性疼痛[20]。当发现KMO 抑制剂能显著改善神经的退行性变，并有助于阿尔茨海默病和亨延顿病的治疗开始，针对KMO 抑制剂的研究就层出不穷，KMO 被认为是比IDO-1 更好的治疗靶向，因为抑制KMO 不仅减少具有神经毒性作用的QUIN 表达，且能增加具有神经保护作用的KYNA表达。但是同时也观察到，KMO 抑制剂并不能减少脑内QUIN 的表达，但是能增加周围KYNA 的表达并穿过血脑屏障引起脑内KYNA 增高。最新的KMO 抑制剂（CHDI-340246 和UPF-648）也不能很好地作用于CNS，主要原因在于药物难以穿透血脑屏障[20,25]。因此，发现一种具有良好血脑屏障渗透性的KMO 抑制剂，以帮助减少CNS QUIN 的分泌并增加KYNA，对神经功能的保护和修复具有重要的意义。在这种情况下，Jacobs 等[26]已经致力于新型KMO 抑制剂的探索，他们尝试利用高通量筛选，致力于发现具有良好CNS 渗透性的结构，并最终应用到SCI 的治疗中去。目前以KP 作为治疗靶向用于治疗SCI 的研究尚浅，进一步的探索两者之内的关系对提高SCI 的治疗具有重要的意义。