淋巴结组织术中快速冷冻切片的优化

郑捷，方庆全，陈安敏

（厦门大学附属第一医院病理科，厦门 361003）

术中快速冷冻切片作为一种工具，已广泛应用于临床外科手术中对患者进行快速组织学诊断，并在此基础上决定手术方案及手术范围。冷冻切片的效率与质量直接影响术中病理诊断的快速性和准确性[1]。淋巴结组织作为术中快速冷冻切片常见的标本之一，组织结构致密，细胞丰富，被膜为致密的结缔组织，且外围常被脂肪组织包绕，因组织成分的特殊性，其冷冻切片一直是病理技术中快速冷冻切片的难点。目前，探索淋巴结组织术中快速冷冻切片条件的报道较少。因此，作者经过实验，从组织冷冻前是否运用“吸水吸油”法、小淋巴结组织的摆放方式及冷冻切片机冷冻头设置的温度3 个方面进行对比，探讨淋巴结组织冷冻切片的优化方案，以期提高淋巴结冷冻切片的效率与质量，为术中病理诊断及手术方案的制定提供保障。

材料与方法

1 材料

标本均来源于2018 年1 月至2019 年7 月厦门大学附属第一医院送检至病理科的120 例淋巴结组织术中快速冷冻标本，包括腋窝前哨淋巴结82 例，气管前淋巴结18 例，右喉返神经旁淋巴结16 例，左右髂总淋巴结4 例。

2 设备与试剂

设备：LEICA CMl950 冷冻切片机(德国莱卡)；DAKEWE(达科为)全自动染色机。试剂：包埋剂，AAF 液 (由95%乙醇A：乙酸A：甲醛F= 85：5：10 组成)，苏木素染液，1%盐酸乙醇液，饱和碳酸锂溶液，0.5%酸化伊红，75%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇等。

3 取材

取材时保持取材台、取材器械干燥，新鲜送检的淋巴结组织应尽量将周围的脂肪组织去除，按以下标准进行取材：淋巴结组织大小＜0.5cm×0.5cm×0.3cm者不进行取材，直接用于冰冻切片，每3 个淋巴结组织置于同一个冷冻切片机托头上（小淋巴结组）；淋巴结组织大小≥0.5×0.5×0.3cm且＜2×2×0.3cm 者，将组织一剖为二，将剖开的两块淋巴结置于同一个冷冻切片机托头上（中等大小淋巴结组）；淋巴结组织大小≥2×2×0.3cm 者，剖开淋巴结，切取一块大小约为 1.5×1.5×0.3cm 的淋巴结组织，置于一个冷冻切片机托头上（大淋巴结组）。经统计，120 例淋巴结术中快速冷冻标本共有冷冻头350 个，其中甲组冷冻头168 个，乙组冷冻头120 个，丙组冷冻头62 个。

4 “吸水吸油”方法

将无粉尘家用擦手纸剪裁成条带状，取材完成的淋巴结组织置于条带的一端，反复轻柔的按压吸去表面的少量水分，将擦手纸对折轻轻推动淋巴结组织向前滚动，尽量将脂滴挤出，随后再将“吸水吸油”后的淋巴结组织进行冷冻切片。此操作尤其需要注意的是“吸水吸油”过程的按压滚动不能过于用力，尽量避免因人为因素造成组织细胞形态的损坏（图1）。

5 冷冻切片的制备

取材后的淋巴结组织是否进行“吸水吸油”操作：从不同取材的小淋巴结组、中等大小淋巴结组、大淋巴结组3 组各取20 个冷冻头，随机分为两组，每组30 个冷冻头。一组淋巴结组织进行“吸水吸油”操作且小淋巴结组织并列排列，加适量的进口OCT包埋剂，将托头连同组织放置于已预先设置冷冻台温度为-25℃，样本头温度为-20℃的冷冻切片机内冷冻后进行制片（“吸水吸油”组）；另一组淋巴结组织不进行“吸水吸油”（非“吸水吸油”组），其余操作同“吸水吸油”组。切片后立即置于AAF液固定30s 后放入DAKEWE 全自动染色机内，按《临床技术操作规范病理学分册》[2]介绍的染色方法进行HE 染色：流水冲洗5s→新鲜配制苏木素染液90s→流水冲洗15s→1%盐酸乙醇液ls→流水冲洗ls→饱和碳酸锂溶液4s→流水冲洗15s→0.5%酸化伊红2s→流水冲洗15s→75%乙醇2s→85%乙醇2s→95%乙醇ls→无水乙醇ls，染色结束吹干，中性树胶封片。统计分析“吸水吸油”组与非“吸水吸油”组冷冻制片的时间和切片质量中无皱褶、无裂隙、无冰晶3 项指标的得分情况。

小淋巴结组织是否并列排列：从小淋巴结组取60 个冷冻头，“吸水吸油”操作后随机分为两组，每组30 个冷冻头。一组（图2C）3 枚淋巴结组织并列排列，其余操作同“吸水吸油”操作组（并列排列组）；另一组（图2D）3 枚淋巴结组织随意放置（非并列排列），其余操作同“吸水吸油”操作组（随意放置组）。统计淋巴结组织并列排列组与淋巴结组织随意放置组的冷冻制片的时间和无皱褶、无裂隙、无冰晶3 项指标的得分情况。

设置不同的冷冻切片机样本头温度：从小淋巴结组、中等大小淋巴结组、大淋巴结组3 组各取30个冷冻头，经“吸水吸油”操作后随机分为3 组，每组30 个冷冻头，冷冻切片机箱体温度均设置为-25℃。第一组设置冷冻切片机样本头温度为-20℃（-20℃组）；第二组设置冷冻切片机样本头温度为-12℃（-12℃组）；第3 组设置冷冻切片机样本头温度为-30℃（-30℃组），其余操作同“吸水吸油”操作组。统计分析冷冻切片机冷冻头温度为-20℃、-12℃、-30℃ 3 组冷冻制片时间及无皱褶、无裂隙、无冰晶3 项指标的得分情况。

图1 “吸水吸油”法具体操作步骤。A，取材完成的淋巴结组织置于纸带的一端；B，将纸带对折，反复轻柔的按压吸去表面的少量水分；C，用纸带轻轻推动淋巴结组织向前滚动，尽量将脂滴挤出Fig. 1 Operation steps of water absorption and oil absorption method. A, the selected lymph node tissue was placed at one end of the paper tape； B, fold the paper tape in half and gently press repeatedly to absorb a small amount of water on the surface； C, gently push the lymph node tissue forward with the paper tape to squeeze out the fat droplets as far as possible

图2 小淋巴结组织排列方式。A，并列排列组3 枚淋巴结组织并列排列；B，随意放置组3 枚淋巴结组织随意放置（非并列排列）Fig. 2 Arrangement of small lymph node tissues. A, Juxtaposed Group； three lymph nodes were arranged side by side； B, Randomly Placed； Group three lymph nodes were randomly placed（not in a row）

6 冷冻制片时效性与切片质量评价

冷冻切片时效性：制片时间从病理医师取材完成后开始计时，制片完成立即置于AAF 液固定视为计时结束，用均数±标准差表示。

冷冻切片质量评价：为保证实验结果的准确性，切片质量评价由两名经验丰富的病理主管技师进行双盲阅片。从组织切片有无皱褶、有无裂隙、有无冰晶3 个方面进行评价，以10 分制评分。评分标准：若切片的组织无皱褶、无裂隙、无冰晶，每项指标得分均为10 分；若切片上a%面积的组织出现相应的指标，则指标得分为10-a/10。例如，某切片上30%面积的组织有皱褶，则该切片无皱褶指标得分为10-30/10=7 分。以此类推。3 项指标得分≥8 分的冷冻切片视为合格切片，指标有一项或多项低于8 分的冷冻切片均视为不合格切片。

7 统计学分析

采用SPSS22.0 统计学软件进行分析,各观察指标用均数±标准差(¯x±s)表示，用配对t检验进行两两比较，计数资料用百分率（%）表示，采用χ2检验分析组间差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 “吸水吸油”操作对淋巴结组织冷冻切片的影响

“吸水吸油”组与非“吸水吸油”组冷冻切片时效性比较：两组冷冻切片制片时间分别为（93.6±0.6）s 和（168.0±2.7）s，“吸水吸油”组制片时间远少于非“吸水吸油”组（P＜0.01）。

两组冷冻切片质量评价指标得分结果见表1。由表1 可见，“吸水吸油”组无皱褶、无裂隙2 个方面指标均显著高于非“吸水吸油”组，差异有统计学意义。“吸水吸油”组（图3A）冷冻切片组织间隙小，皱褶现象较少见；非“吸水吸油”组（图3B）组织间隙宽，出现大面积的皱褶现象，极大影响术中冰冻的诊断。两组无冰晶指标得分相近，差异无统计学意义。“吸水吸油”组3 项指标得分≥8 分有26 个冷冻头，合格率为87%（26/30），非“吸水吸油”组3 项指标均≥8 分仅有3 个冷冻头，合格率为10%（3/30），两组合格率比较差异有统计学意义（χ2=35.31，P＜0.01）。

图3 “吸水吸油”操作对淋巴结组织冷冻切片的影响。A，“吸水吸油”组淋巴结组织进行吸水吸油操作，组织间隙小，皱褶现象较少见；B，非“吸水吸油”组淋巴结组织没有进行吸水吸油操作，组织间隙宽，出现大面积的皱褶现象；比例尺，300μmFig. 3 Effect of “water absorption and oil absorption method” on frozen section of lymph node tissue. A, in “water absorption and oil absorption” operation group, “water absorption and oil absorption” operation was performed for lymph node tissues, which showed small tissue gaps and rare wrinkles； B, in Non-”water and oil absorption “operation group, “water absorption and oil absorption” operation was not performed for lymph node tissue, with wide tissue gaps and large area of wrinkles； scale bar, 300μm

表1 淋巴结组织是否进行“吸水吸油”操作3 项切片质量得分Tab.1 Three indexes-based quality scores of the sections of lymph node tissue in two groups operated with or without the steps of “water absorption and oil absorption”

2 小淋巴结组织是否并列排列对淋巴结组织冷冻切片的影响

并列排列组与随意放置组冷冻切片时效性比较：2 组冷冻切片的制片时间分别为（104.4±0.7）s和（106.4±0.8）s，制片时间差异无统计学意义（P＞

0.05）。

2 组小淋巴结组织冷冻切片的质量评价指标得分结果见表2。并列排列组小淋巴结组织较平坦，皱褶较少，随意放置组淋巴结组织皱褶面积较多，并列排列组无皱褶指标得分高于随意放置组，差异有

统计学意义。两组无裂隙，无冰晶指标得分相近，差异无统计学意义。并列排列组3 项指标得分≥8分有24 个冷冻头，合格率为80%（24/30），随意放置组3 项指标均≥8 分有6 个冷冻头，合格率为20%（6/30），2 组合格率比较，差异有统计学意义（χ2=21.60，P＜0.01）。

表2 小淋巴结组织是否并列排列的3 项切片质量得分情况Tab.2 Three indexes-based quality scores of the sections of lymph node tissue in two groups with tissues arranged in parallel or in random

3 不同的冷冻切片机样本头温度对淋巴结组织冷冻切片的影响

样本头温度-20℃、-12℃、-30℃ 3 组冷冻切片时效性比较：3 组冷冻切片制片时间分别为(93.6±0.5)s、(142.1±0.8)s 和(129.0±1.0)s，温度-12℃组、-30℃组与-20℃组冷冻切片的制片时间相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图4 冷冻切片机样本头温度对淋巴结组织冷冻切片的影响。E，样本头温度设置为-20℃的淋巴结冷冻切片组织间隙小，皱褶、冰晶现象少见；F，样本头温度设置为-12℃的淋巴结冷冻切片出现大面积的皱褶现象；G，样本头温度设置为-30℃淋巴结冷冻切片出现较大面积的裂隙(黑箭头所示)、冰晶现象（红箭头所示）；比例尺，300μmFig.4 Effect of temperature settings of freezing microtome on frozen section of lymph node tissue. E, the frozen sections of lymph nodes with a temperature set at -20℃ showed small tissue gaps, few wrinkles and ice crystals； F, the lymph node frozen section with the sample head temperature set at -12℃ showed large area of wrinkles； G, the lymph node frozen section with the sample head temperature set at -30℃ showed a large area of cracks (indicated by black thearrow) and ice crystals appeared in the frozen section of lymph nodes (indicated by red arrow)； scale bar, 300μm

3 组不同冷冻切片机样本头温度下淋巴结组织的冷冻切片质量评价指标得分结果见表3。-20℃组组织间隙小，皱褶、冰晶现象较少见，-12℃组（图4F）冷冻切片出现较大面积的皱褶现象，-30℃组（图4G）切片则出现较大面积的裂隙、冰晶现象。 -20℃组3 项指标得分≥8 分有28 个冷冻头，合格率为93.3%（28/30）；-12℃组3 项指标均≥8 分有4个冷冻头，合格率为13.3%（4/30）；-30℃组3 项指标均≥8 分有0 个冷冻头，合格率为0%（0/30）。-12℃组、-30℃组2 组与-20℃组的合格率相比较，差异均有统计学意义（χ2=38.57，52.50，P＜0.01）。

表3 不同的冷冻切片机样本头温度下淋巴结组织3 项切片质量得分情况Tab.3 Three indexes-based quality scores of the sections of lymph node tissue in three groups with different settings in sample head temperature of freezing microtome

讨 论

冷冻切片是将组织快速冷冻成一定的硬度，切出薄片的过程[3]。病理医师对可疑病变组织术中冷冻切片作出的初步诊断对外科手术医师明确病变性质、制定下一步的手术方案有极其重要的指导意义。以前哨淋巴结为例，冷冻切片检查对诊断乳腺癌前哨淋巴结是否转移特异性较高，是一种较为可靠而快速的方法[4]。Ales-sandro 等[5]对137 例早期乳腺癌患者250枚前哨淋巴结冷冻切片检查发现，冷冻切片对淋巴结微转移特异性和阳性预测值均为100%，宏转移和微转移的敏感性分别为83.3%和40%，指出前哨淋巴结术中冷冻切片可以较准确判断乳腺癌前哨淋巴结的癌转移情况。乳腺癌患者依据淋巴结术中冷冻切片的结果来决定是否进行腋窝淋巴结清扫术，其阳性患者可通过一次的手术完成腋窝淋巴结清扫，从而避免二次手术的费用负担和手术风险[6]。而淋巴结术中冷冻切片质量的好坏直接关系到病理医师诊断的准确率。

冷冻切片质量的影响因素众多，许多病理技术工作者为了提高冷冻制片的质量进行了各种条件的摸索。王玉环等[7]通过优化乳腺组织取材大小、速冻方法、切片厚度等条件，发现取材大小为1×1×0.2cm～2×1.5×0.3cm，预先制作“带垫”的托头，切片厚度以5cm 及 6um 有利于提高乳腺冷冻制片的速冻效率、减少组织块崩裂、减少冰晶。淋巴结组织组织结构特殊，尽管病理操作规范要求取材医师取材时尽量把淋巴结周围的脂肪去除，但日常临床工作发现，脂肪组织难以完全剔除，这些特征都决定了淋巴结组织冷冻切片较其他组织切片难度大得多。

“吸水吸油法”是在病理医师取材完成后，由病理技师将组织放进冷冻切片机箱体前在室温下进行的一项操作，其目的是将淋巴结组织表面的少量水分吸去并将脂肪组织中的脂滴轻轻挤出，尽量减少无法完全剔除的脂肪组织对淋巴结组织冷冻切片的干扰。因此作者采用 “吸水吸油”处理冷冻切片前的淋巴结组织，极大缩短了冷冻切片的时间，提高冷冻制片的质量，且方法简便易行，降低患者在手术台上因等待病理冷冻切片报告时间过长而引起并发症的可能。但是，必须强调的是，“吸水吸油法”在滚动按压操作过程中，一定注意操作的力度，避免人为因素导致组织结构、细胞形态的改变。

在实践中发现，当多枚淋巴结置于同一个速冻头上时，淋巴结组织的摆放位置对冷冻切片的质量也有一定的影响。放置组织冰冻前，应视组织的形状和走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，若胡乱放置，就不能收到很好的效果。随意放置淋巴结则组织之间容易相互干扰，多枚淋巴结并列排开可以将淋巴结组织之间的干扰降到最低，用毛笔刷轻轻按压，降低了切片卷起的概率，大大减少了淋巴结组织的皱褶现象。

速冻温度是影响冷冻切片质量的重要因素之一。不同组织冷冻切片温度的调整原则是柔软稚嫩富含水分的组织选择较高的温度，温度过低容易造成切片成碎屑状；较为致密富含脂肪的组织选择较低的温度，温度过高组织堆积不能形成片状[8]。冷冻温度的设置根据组织的种类、厚度、大小来调节，温度的把控应该量化：脂肪组织速冻最适温度是-30℃～-25℃，淋巴结组织速冻最适温度是-15℃～-10℃，两者最适速冻温度不一致[9]。作者将切片机箱体冷冻台温度设置在-25℃，待组织冷冻制成冻块立即取下冻头，以防因冷冻时间过久导致组织过硬出现裂隙。作者将冷冻切片机样本头温度进行调整，尝试了不同的样本头温度对淋巴结组织术中快速冷冻切片的影响。虽然对淋巴结组织进行了“吸水吸油”操作，但淋巴结周围的脂肪组织不可能完全去除，因此选择最佳的样本头冷冻温度十分关键。当样本头温度设置于-12℃时，淋巴结组织冻好而脂肪组织未冻上，脂肪组织成泥状，导致淋巴结组织冷冻切片出现大面积的皱褶，无法满足镜检要求。组织含油脂多的时会促使冰点大幅下降，使组织结冰时间延长，组织硬度下降，制片困难；当样本头温度设置于-30℃时，适合脂肪组织冷冻制片，但淋巴结组织因温度过低切片呈碎屑状，无法制片或出现大面积的裂隙，若将冷冻头置于冷冻箱外复温或者用手放置于组织上稍加热后再切片，温度的改变则会导致切片中出现大量的冰晶，影响病理诊断的准确性。实践发现，当样本头温度设置于-20℃时淋巴结组织冷冻切片的时间明显缩短，切片质量也得到明显提高。

综上所述，淋巴结组织 “吸水吸油”操作、多枚淋巴结组织置于同一个冷冻头上时将淋巴结组织并列排开且设置冷冻切片机样本头温度于-20℃，优化这3 方面的条件能显著提高淋巴结组织冷冻切片的制片效率与切片质量，为术中病理诊断及手术方案的制定提供保障，值得广为推广。