改良的动脉内皮细胞铺片技术—医学形态学与医学机能学的实验教学融合设计

王婧婧，李莉，郭晓笋，邴鲁军，马保华，刘尚明

山东大学基础医学院 1 病理生理学教研室 2 医学形态学实验室 3 组织学与胚胎学教研室，济南 250012

动脉内皮细胞铺片技术由Schwartz 等[1]首次建立。相对于动脉横断面切片，该技术将待研究血管纵行剖开，内皮面朝上固定在特殊处理玻片上，可以大范围呈现在体血管内皮细胞、进行直观的形态学观察，结合免疫组织化学、原位杂交等方法，还能对在体动脉内皮细胞的损伤程度、细胞因子释放功能、增殖和凋亡水平等进行定量分析[2-6]，可作为早期观察动脉血管内皮细胞形态变化及进行多种血管损伤评价的有力手段。但这一实验技术步骤繁多、试剂配制复杂，许多环节操作不慎极易导致铺片失败，因此需要进行细致的优化和改良，才能适应实验教学的需要。

在当前以岗位胜任力培养为导向的医学教育改革背景下，医学形态学与医学机能学的实验教学融合，是医学学科特性的必然选择[7]。首先，生物体结构决定功能，功能影响结构，二者协同统一；其次，机能、形态实验序贯教学，可相对完整地模拟临床疾病的发生、发展、转归过程中机体系统、组织、器官、乃至细胞（分子）水平的结构与功能改变的关键环节与核心过程。因此，医学形态学与医学机能学的有机融合，不仅是医学相关课程理论学习的整合，也是医学生早期感知、认知临床疾病较理想的情景与场所，更是早期培养医学生发现问题、分析问题、解决问题的临床思维模式与基本能力的最佳途径之一。

为了提高实验目的性、可观察性和可操作性，提高实验成功率，本研究优化和改良了动脉内皮细胞铺片技术。为了强化学生对动脉粥样硬化这一病理过程的全方位认识，培养学生的综合和创新能力，本研究设计增加了机能学实验内容，学生分组完成对高脂和普通饮食大鼠的功能、代谢到组织学变化的观察和分析。

材料与方法

1 教学对象

面向山东大学临床医学专业五年制、本硕和齐鲁医学班学生。学生自由选课，分为2 个大组，每组分6～9 个实验组，每个实验组至少3 名学生，共14～18 学时。

2 材料与试剂

SPF 级健康 4 周 龄雄性 SD 大鼠 20 只，体重85～108 g，购自山东大学实验动物中心，明胶、多聚甲醛、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、苏木素染液、伊红染液等均购自济南亿飞科贸有限公司。

3 试剂的配制及铺片制备

由老师实验前配制完成。

3.1 明胶铺底片

烧杯内加入1000ml 水后加入5g 明胶，玻璃棒轻轻搅拌，低温加热至明胶溶解，再加入铬明矾0.5g溶解， 尽快放入冰水盆内，使溶液温度降至20℃。将洗干净的载玻片放入该溶液中5～10min，控干后放入37℃烤箱内烤干。

3.2 覆盖明胶玻片

1g 明胶加入20ml 蒸馏水中，在水浴锅中煮溶解。明胶铺底片提前半小时放入60℃烤箱，然后将煮好的明胶溶液，用滴管平行均匀的涂在明胶铺底片上，重复涂3 次，使液体垂直流下，再将铺片放平，放入37℃烤箱内5h，该片应当天使用。

3.3 配制中性缓冲固定液

37%甲醛溶液100ml，4g 磷酸二氢钠和6.5g 磷酸氢二钠加至1000ml 蒸馏水中溶解。

3.4 配制4%多聚甲醛溶液

40g 多聚甲醛加入500ml 蒸馏水，用玻璃棒搅动加热至60～70℃，再加入1～2ml 5mol/L 氢氧化钠溶液，使溶液清澈，冷却至室温、过滤，测量体积，加入等量0.2mol/L pH7.2 的磷酸缓冲液（14g 磷酸氢二钠，2.7g 磷酸二氢钾加水至500ml），使pH 值为7.2～7.4。

4 制作动脉粥样硬化动物模型

开课前8 周由老师制作完成：20 只健康雄性SD 大鼠分别给予高脂饮食（猪油10%，蔗糖20%，蛋黄粉8%，胆盐1%，蛋氨酸2%，基础鼠料59%）和正常饮食，自由摄食和饮水的条件下饲养8 周后进行后续试验。

5 教学实施

5.1 第一次课：大鼠血清生化指标测定、主动脉取材与固定

4 学时，学生分组完成。大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠（35mg/kg 体重）进行麻醉，心尖取血，离心分离血清，应用全自动生化分析仪（日立7600）测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平以及谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）指标变化，各样本生化指标测定时均设2 个平行孔。

大鼠颈总动脉插管，恒压灌注4%多聚甲醛（pH7.2），持续10min，然后分离主动脉，置于4%多聚甲醛固定液内。

5.2 第二次课：大鼠主动脉内皮细胞铺片制作

4 学时，学生分组完成。将大鼠主动脉从固定液中取出并沿纵轴剖开血管，切成1cm 左右动脉段，内皮面朝上用钢针固定于特氟龙板上（如果做后续免疫组织化学和原位杂交染色，可从这步开始一直到DAB 显色）。

35%、50%、75%、85%、95%、100%、100%乙醇脱水各5min， 将2%火棉胶（1ml 乙醚， 1ml乙醇和1.5ml 火棉胶配制）滴于动脉内皮上，将标本内膜面朝下压贴在火棉胶片上，室温放置30min。

将粘上大鼠主动脉的火棉胶片放入35%乙醇内充分浸润，30min 后拿出并剥离动脉外膜和中膜，接着滴入温热的10%明胶覆盖血管内膜。放湿盒内室温1h，甩掉过多的明胶后，将内膜面朝下反转压贴在明胶涂片上，然后加压固定好，置入中性缓冲固定液中。

5.3 第三次课：大鼠主动脉内皮细胞铺片的HE 染色

4 学时，学生分组完成。大鼠主动脉内皮细胞铺片经酒精脱水35%→50%→70%→95%→100% →100%各5 分钟，放入1:1 乙醇/乙醚溶液中15 分钟×3 次（溶解火棉胶，每次都需要新配），便得到一层腔面朝上的内皮细胞铺片。

经 水 化100%→100%→95%→95%→35% 各5 分钟，4℃蒸馏水冲洗3 分钟×5 次。苏木素染色3分钟，流水冲洗5 分钟。经70% → 80% → 90% → 95% → 100% → 100% → 二甲苯Ⅰ → 二甲苯Ⅱ 脱水透明后，中性树胶固定封片。

5.4 第四次课：整理数据，统计学分析

2～4 学时，课上集中讨论，课下完成数据分析。汇集多班次、多组别的实验结果，提供给每组学生明确的数据，共同进行统计学分析。让学生在实践中学习分工合作、从而共同达到学习目标。

5.5 选做

联合免疫组织化学技术进一步观察血管内皮细胞损伤情况。实验前与同学一起阅读相关文献[8]，血管内皮细胞受损后合成和释放内皮素-1（Endothelin-1, ET-1）增多，而ET-1 又能引起血管收缩、加重内皮细胞损伤和促进平滑肌细胞增殖, 从而参与心脑血管疾病的发生发展。因此，检测血管内皮细胞ET-1 的表达情况可以说明其损伤程度。学生根据自己实际情况决定是否继续进行免疫组织化学实验，由教师提前购置试剂，进行下一步染色。

结 果

1 实验各组大鼠体重、血脂和肝功能代谢指标的变化

收集所有组数据，应用SPSS 行单因素方差分析和t检验。与正常饲料喂养组大鼠相比，高脂饲料组大鼠体重增加不明显，但血清TC、TG 和LDL-C 明显升高， HDL-C 明显降低，肝代谢指标AST、ALT和ALP 水平明显增高（表1）。

表1 大鼠增重、血脂和血清ALT, AST 和ALP 变化Tab. 1 Comparison of gaining weight, serum lipids, ALT, AST and ALP levels in 2 groups

2 实验各组动脉内皮细胞铺片结果

HE 染色显示，正常饲料组大鼠内皮细胞核呈椭圆形，核轮廓清晰，沿长轴排列，分布均匀；高脂饲料组动物内皮细胞排列不规则，细胞密度增加。结合免疫组织化学方法，光镜下计数每组标本ET-1 阳性细胞数，并应用SPSS 行单因素方差分析和t检验显示，正常饲料组大鼠ET-1 阳性细胞数量较少，高脂饲料组 大鼠ET-1 阳性细胞数量明显增多（0.01＜P＜0.05）（图1）。

图1 动脉内皮细胞铺片HE 染色联合免疫组织化学技术观察内皮细胞的形态学变化。A，正常组大鼠内皮细胞铺片（HE 染色）； B，高脂组大鼠内皮细胞铺片（HE 染色）； C，正常组大鼠内皮细胞铺片（ET-1 免疫组织化学染色）；D，高脂组大鼠内皮细胞铺片（ET-1 免疫组织化学染色）；比例尺 25μmFig.1 The morphological changes of endothelial cells by artery endothelium preparation combined with HE and immunohistochemical staining. A, control group (HE staining)； B, hyperlipidic group (HE staining)； C, control group (ET-1 staining)； D, hyperlipidic group (ET-1 staining)； scale bar, 25μm

讨 论

血管内皮细胞的功能变化是血管损伤机制的始动环节[9]，体外及在体研究均需借助一个方法清晰地显示血管内皮细胞形态，尤其是在体模型。简单的血管横断面病理切片难以观察一层血管内皮细胞的变化，更无法进行定量研究。血管内皮细胞铺片技术的建立，使大范围地呈现在体血管内皮细胞成为可能，并可稳定地用于免疫组织化学、原位杂交等研究方法。传统的动脉内皮细胞铺片技术制作步骤繁多、流程复杂，许多环节操作不慎极易导致铺片失败，并很难在有限的实验课时内完成，极大的限制了此实验项目在实验教学中的推广应用。

我们通过不断的实验摸索，对操作环节进行改进，如玻片包被、血管组织脱水及烤片等环节，使大鼠血管内皮细胞铺片的制备质量明显提高：技术改良后的大鼠血管内皮细胞铺片，内皮细胞分布均匀、背景干净、无过多着色。本实验结果还证明，经过细致充分的实验准备后，学生可以在既定时间内完成实验内容，达到预期学习目标提高学生的实践水平。

此外，为适应新时期医学实验教学改革，我们设计、增加了机能学实验内容，将高脂饲养和普通饮食的SD 大鼠先从功能和代谢方面进行分析比较，再利用改良后的动脉内皮铺片技术对组织学进行形态学观察，将机能、形态学与疾病的发生发展有机地融为一体。有助于建立学生的医学整体观和临床思维，可作为一门新的医学形态学实验教学内容。