治疗性单抗Fc 功能及工程改造研究进展

于德玲，黄长江，王名雪

(烟台迈百瑞国际生物医药有限公司, 山东 烟台 264006)

利用治疗性单克隆抗体进行靶向治疗已经成为对抗癌症、病毒感染以及免疫性疾病的一种有效的手段。该治疗性单克隆抗体可以通过直接或者间接的机制对肿瘤细胞进行诱导死亡。直接机制包括阻断生长因子受体信号转导、直接跨膜信号转导以及同放射性同位素或者化药[1,2]一样作为有毒有效的靶向载体；间接机制需要与宿主免疫系统的成分结合，包括补体介导的细胞毒性作用（complement- dependent cytotoxicity，CDC）、抗体依赖性细胞介导的细胞吞噬作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP）和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）等。直接机制主要依赖于抗体结合片段（antibody binding fragment，Fab），Fab 能够特异性的识别肿瘤细胞表面的相关抗原（tumor-associated antigen，TAA），来调控与该抗原相关的信号通路；间接机制主要依赖可结晶区域（Fc），Fc 可以结合表达在免疫细胞表面的Fc 伽马受体（FcγR），从而发挥一系列的生物学功能来提高治疗型单抗的功效。有些靠直接机制发挥作用的抗体，可能并不需要Fc 区介导的CDC、ADCP 和ADCC 作用；而靠间接机制发挥作用的抗体，反而希望将其Fc 区介导的CDC、ADCP 和ADCC 作用发挥到最大。因此，为了提高治疗性单克隆抗体的治疗效果，研究其结构与功能，并针对抗体Fc 区域的工程改造成为当今抗体工程研发领域的一个热点。

1 IgG 抗体结构

免疫球蛋白G （IgG）是人血清中最丰富的蛋白质之一，约占血浆蛋白的10%～20%。IgG 也是5类免疫球蛋白（IgM、IgD、IgG、IgA 和IgE）中主要的一类，分为4 种亚型。人体中的IgG 抗体亚型于20 世纪60 年代被发现，以发现的时间顺序命名为IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4[3]。尽管二硫键的位置和数目不同，但4 种亚型抗体的空间结构很相似，均是由4 条多肽链通过链间二硫键连接，其中两条是相同的50kDa γ 重链，两条是相同的25kDa κ 或λ 类型的轻链。每条重链由氨基（N）末端的可变区（VH）和恒定区（CH1、CH2 和CH3）组成，其中CH1 与CH2 之间还有一段铰链区。同样，轻链是由N 末端的可变区（VL）和恒定区（CL）构成。轻链与重链的VH 和CH1 区共同构成了可与特异性抗原结合的Fab 区域，而重链的铰链区及铰链区连接的CH2 和CH3 区共同构成Fc 区域。IgG 抗体各亚型的结构示意图如图1 所示。

图1 IgG 抗体结构示意图[3]Fig. 1 Schematic diagram of IgG antibody structure

2 IgG 抗体Fc 区域的作用机理

在人类中，该蛋白质家族包括FcγRI（CD64），又细分为同种型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII（CD32）分为同种型FcγRIIa（包括同种异型H131和R131）、FcγRIIb（包括FcγRIIb-1 和FcγRIIb-2）和FcγRIIc，FcγRIII（CD16）分为同种型FcγRIIIa（包括同种异型V158 和F158）和FcγRIIIb（包括同种异型FcγRIIIb-NA1 和FcγRIIIb-NA2）[5]。这些受体具有典型的胞外域、跨膜区和胞内域，其中胞外域介导与Fc 的结合，胞内域可能介导细胞内的一些信号转导。这些受体表达于多种免疫细胞中，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B 细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯（Langerhans）细胞、天然杀伤（NK）细胞等，从而介导免疫系统中各种免疫细胞之间进行通讯。

Fc/FcγR 复合体的形成可以有效地募集相应的效应细胞，从而导致细胞内的信号转导以及后续一系列重要的免疫反应，诸如炎症介质的释放、B 细胞活化、胞吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击等。抗体破坏靶细胞的潜在机制是通过介导细胞毒性和吞噬细胞的效应器功能实现的。其中表达FcγR 的免疫性细胞通过识别靶细胞上结合的抗体被募集到靶细胞表面，随后释放细胞毒素引起靶细胞裂解，这种反应称为ADCC。同理，引起靶细胞的吞噬作用的反应称为ADCP[6]。所有FcγR 结合Fc 上的相同区域，位于CH2 结构域N 末端和前面的铰链。此外，抗体Fc 与血清补体分子（C1q）结合，启动补体级联蛋白的组装，形成膜攻击复合体来清除靶细胞。此过程称为CDC。

Fc 区域对IgG 抗体的体内循环半衰期也至关重要。血清IgG 的半衰期较长，这是由于Fc 与新生儿受体（FcRn）之间存在pH 依赖的相互作用和循环机制。FcRn 主要在内涵体中表达，能够通过胞饮作用内化IgG。IgG 的CH2-CH3 结构域中保守的组氨酸残基在酸性内涵体pH（6.0～6.5）下质子化，驱动pH依赖性结合FcRn 的α-链，随后在生理pH（7.4）下将IgG 再循环并释放到血液中，从而避免抗体在溶酶体中被降解。最新研究表明，来自人类巨细胞病毒的US11 蛋白可抑制FcRn 的组装，从而抑制Fc与FcRn 结合，结果病毒导致肠或胎盘上皮细胞的IgG 转运减少，并且增加血管内皮细胞中IgG 抗体的降解。这也是学术界第一次发现一种病原体，可以采用这种机制来破坏FcRn 受体功能，并降低抗体抵抗病源微生物感染的能力，这为自身抗体的过度生产而产生的自身免疫疾病提供了一种治疗的新方向[7]。

Fc 区域与FcRn 上的关键接触位置包括L251、M252Y（Fc 突变之一）、I253、L309、H310、L314、Q311 和N434，研究证实H310 的强氢键是pH 依赖性结合的关键，该氨基酸突变为任何其他氨基酸（不包括半胱氨酸）则在pH6.0 下不能检测到与FcRn 的结合[8]。FcRn 介导的抗体再循环机制与治疗性抗体药代动力学（PK）息息相关，是研究者比较关注的问题。

3 IgG 抗体亚型及Fc 区功能差异

IgG 各亚型之间结构相似，但IgG1 与IgG2、IgG3、IgG4 恒定区的氨基酸序列在许多位置存在多态性，如图2 中红色字体标记。而且它们与Fc 受体的亲和力各不相同，IgG1 同IgG3 与Fc 受体的结合亲和力要高于IgG2 和IgG4，因此功能上也有差异。IgG1 和IgG3 具有更强的ADCC、ADCP 和CDC 作用，而IgG2 与IgG4 的ADCC、ADCP 和CDC 作用相对较弱。

3.1 IgG1

IgG1 在血浆中的含量最多，也是重组抗体药物应用最多的亚型。通常可溶性抗原及膜蛋白引发的抗原抗体反应，首先诱导产生的是IgG1，一般伴随着少量的其他亚型，通常是IgG3 和IgG4[9]。由于IgG1 含量最多，因此IgG1 的缺乏主要出现在原发性或继发性抗体的缺乏之时，这通常也会导致总的IgG 缺乏。IgG1 伴随着其他亚型的缺陷有时与复发性感染相关[10]。IgG1 能够结合各种Fc 受体，从而引发ADCC、ADCP 以及CDC 效应。靶向PD-L1 结合的类似抗体Avelumab（Bavencio）就是保留了Fc端ADCC 和ADCP 作用的IgG1 亚型单抗，这样一方面可以靶向PD-L1 阻断PD-1 和PD-L1 的相互作用，另一方面还可借助ADCC 和ADCP 作用对肿瘤细胞“补刀”。

6)当层结稳定度强出现急流和转子时,因急流两侧风的垂直切变很大,导致该处可能出现飞机颠簸现象,该现象通常出现在大气高层和中层;此两处分别接近喷气和螺旋桨飞机的巡航高度,故在航空飞行保障中对此必须加以重视。

3.2 IgG2

细菌感染引发的抗原抗体反应多引发诱导产生IgG2，某些细菌感染几率的增加多与IgG2 的缺乏有关，这说明IgG2 在这些病原体的防御中发挥作用。IgG2 的铰链区比较短且不灵活，且其与FcγRs的亲和力最弱，但是IgG2 能够通过与FcγRIIa 的结合引发单核细胞介导的ADCC 与巨噬细胞介导的ADCP[11]。此外，IgG2 的铰链区上游存在额外的Cys残基，因此会形成二硫键异构体影响IgG2 分子的空间构象与功能，IgG2 分子的铰链区对于蛋白酶切割是稳定的。对于一些纯拮抗作用的抗体来说，并不需要FcγRs 带来的作用，因此Fc 作用弱的IgG2 被选择用来作为骨架，如已上市的以IgG2 为骨架的单抗有Tositumomab(Bexxar)、Panitumumab(Vectibix)、

Denosumab(Prolia)、Evolocumab(Repatha)。

3.3 IgG3

IgG3 由于其半衰期比较短并且铰链区域易水解，限制了其在药物中应用。但是，也有研究表明，较长的铰链区在做融合蛋白时会增大抗体Fab 的伸展柔性[12]。由图2 也可以看出，IgG3 的铰链区比其他亚型的要长。其核心铰链区有11 对二硫键，因此对于蛋白酶切割不稳定。IgG3 与Fc 受体的结合能力最强，能够引发ADCC、ADCP 和CDC，且CDC效应比IgG1 更强。因此有研究将IgG3 的Fc 区域与IgG1 的CH1 和铰链通过基因重组构建完整抗体结构，显示出明显的CDC 效应增强，超过野生型水平。但proteinA 结合位点会消失，将IgG3 的CH3末端与IgG1 的替换即可恢复该特性[13]。

3.4 IgG4

IgG4 分子的铰链区较短，且其与FcγRI 之外的FcγRs 结合较弱。IgG4 分子不能引起CDC 和NK细胞介导的ADCC，但是能引起巨噬细胞介导的ADCP。在体内，IgG4 分子会经历Fab-arm 交换的过程，从而形成半分子以及双特异的功能单价的抗体。S228P 能够稳定IgG4 分子，阻止半分子的形成[14]。另一方面，已发现天然IgG4 在压力条件下（诸如在酸性缓冲液中或在温度升高时）不太稳定[15]。但是同样作为PD-1/PD-L1 免疫检查点抑制剂，IgG4 亚型的纳武单抗和派姆单抗要比IgG1 亚型的阿特珠单抗、Imfinzi 和Bavencio 在临床上更有效。这可能与IgG4 亚型独特的特性有关，其与多数FcγR 受体具有较弱的亲和力，并且缺乏激活补体的能力，被称作典型的“阻断性抗体”，呈现相对的非炎症特性，更适合用于治疗性单抗生产。

图2 IgG 抗体4 种亚型恒定区基因序列对比[16]。红色字体指IgG1-4 氨基酸序列之间的不同，其中N297 糖基化位点也用红色标出；氨基酸序列依据EU 索引编码；绿色标记位点与FcRn 结合相关，黄色与FcγR 结合相关，蓝色与补体C1q 的结合相关Fig. 2 Constant region sequence alignment of 4 subtypes of IgG. The red font is the different site of amino acids between IgG1-4 and the glycosylation site of N297； amino acids are encoded according to EU index, green marker loci were correlated with FcRn； yellow font is associated with FcγR； blue font is correlated with complement C1q

4 Fc 区域的改造策略

单克隆抗体发展至今，已有超过60 多种抗体药物上市，尽管治疗性抗体在临床和商业上取得了成功[17]，目前仍有许多类型的疾病对其使用抗体治疗方法没有临床效果。除了传统的单克隆抗体，抗体工程技术的进步加上对抗体Fc功能更深入的了解，以及高通量筛选系统的建立，均为Fc 工程变体开辟了新的途径。这些Fc 变体具有更高的血清稳定性，以及抗原结合的特性，现在已经有多种方法可以开发专为实现某项功能而定制的Fc 变体。

4.1 糖工程方法

人类IgG 有两个位于Asn297 的双触角聚糖，由N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖组成核心，外围由岩藻糖，半乳糖，和唾液酸构成。在抗体的商业化生产过程中，糖基化是高度不均匀的，这取决于细胞系、培养条件以及下游的加工步骤，超过20 种不同的聚糖变体已在单一IgG 抗体产品中得到鉴定[18]。糖基的存在和组成在很大程度上影响Fc 构象、FcγR 结合和效应功能[19]。由于Fc 聚糖对治疗效果的高度相关性，对Fc 聚糖的组成进行优化，可以增强FcγR 的结合和效应功能。

研究表明去除岩藻糖可显著增强FcγRIIIa 亲和力、ADCC 活性[20]。因此研究人员一直努力通过敲除岩藻糖转移酶基因(Fut8KO)或过表达N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III (GnTIII)构建细胞系，来生产去除岩藻糖的抗体[21]。唯一商品化的抗G 蛋白偶联受体的抗体Mogamulizumab (anti-CCR4: kw-0761)，作为糖工程学最伟大的成就之一，其含有去岩藻糖的Fc区域，显著提高了与NK细胞表面的FcγRIIIa的结合能力以及ADCC 效应。该商品化抗体已于2012 年在日本批准用于治疗复发或难治性患者T 细胞白血病淋巴瘤 (adult T-cell leukemia/lymphoma，ATLL)。在美国，正在进行二期和三期临床试验，以验证其有效性和安全性[22]。Obinutuzumab (Gazyva: anti-CD20, GA101)是另一种经批准的用于增强ADCC 的去岩藻糖的抗体。它以一种独特的结合方式靶向CD20，与非糖工程利妥昔单抗相比，它能更好地清除CD20阳性白血病细胞。该药物于2013 年被美国FDA 批准与氯霉素联合用于治疗难治性慢性淋巴细胞白血病[23]。

除岩藻糖外，半乳糖和唾液酸，在很大程度上影响IgGs 在人体免疫系统中的免疫作用。例如抗EGFR 抗体上的聚糖可以是四种不同类型之一：低半乳糖化、高半乳糖化、单唾液酸化或双唾液酸化，在这些类型中，与低半乳糖化IgGs 相比，高半乳糖化IgGs 具有更高的FcγRIIa 和FcγRIIIa 结合亲和力。Fc 的N-链寡糖上末端存在的唾液酸对人的炎症状态有显著的影响[24]。唾液酸化增强了Fc 与FcγRIIa的结合亲和力，但对FcγRIIIa 结合或ADCC 活性没有显著影响[25]。人IgGs α，2，6-唾液酸化的寡糖被认为是最具有代表的人类蛋白质末端的糖基化，且具有抗炎作用；然而，CHO 细胞中仅产生α，2，3-唾液酸化抗体而且没有显示出抗炎活性。通过研究表明可以使用多种糖苷内酯酶催化的反应，可以将利妥昔单抗的聚糖被成功修饰为末端α，2，6-唾液酸化[26]。

4.2 蛋白工程方法

在过去的20 年里，随着生物信息学及计算机技术的发展，计算机模拟越来越多的被应用到蛋白质工程中，从而衍生出半合理化设计及合理化设计等新的手段。传统的蛋白质工程多引入随机突变来改造目的蛋白的结构和功能，常用的技术包括易错PCR（Error-Prone PCR），体外同源重组技术（DNA Shuffling）等。基于结构信息，计算机设计、酵母展示、不对称工程以及定点突变技术[27]，已产生许多Fc 变体来改变与其受体的结合能力（表1）。

据报道，含有双突变（S239D/I332E）Fc 的抗CD19 抗体以及抗CD40 的抗体对B 细胞淋巴瘤和白血病细胞的细胞毒性较含有野生型Fc 的对应抗体增强约两个数量级[28,29]。此外，与野生型抗CD96 的scFv 与Fc 的融合蛋白相比，Xencor 公司开发的抗CD96 的scFv 与Fc 融合蛋白的三突变体（S239D/A330L/I332E），其ADCC 活性显著提高[30]。基于同样的开发方法，有研究者筛选到一个Fc 突变（G236A），该突变在抑制FcγRIIb 的基础上选择性激活FcγRIIa（两者具有96%的序列一致性），用于提高由单核细胞来源的巨噬细胞介导的ADCP[31]。同时G236A 与S239D/I332E 联合应用可以来增强巨噬细胞介导的ADCP 以及NK 细胞介导的ADCC。而且，Xencor 公司还设计了一种作为自身免疫性疾病的潜在治疗药物抗CD19 Fc 突变体（S267E/L328F），它通过与B 细胞受体和FcγRIIb共同作用，使其与FcγRIIb 结合亲和力增加430 倍，从而抑制了人B 细胞的增殖[32]。由于FcγRIIb 和FcγRIIaR131 在结构上是相似的，因此一般Fc 突变体在提高FcγRIIb 的结合亲和力的同时，也在一定程度上增强了与FcγRIIaR131 亚型的结合亲和力。通过在238 位将Pro 突变为Asp 来改变CH2 结构域的构象，可以用来仅提高FcγRIIb 的结合亲和力[33]。这样选择性增强FcγRIIb 结合的Fc 变体，为提高抗体治疗的有效性提供了一个新的工具。

Fc 变体除了用来提高与其受体的结合能力，Fc与C1q 的结合也是引发CDC 反应的关键因素，因此已有许多研究用来提高Fc 与C1q 的结合亲和力，通过丙氨酸扫描已经确定D270、K322、P329 和P331是影响其结和亲和力的关键残基[34]。Fc 与FcRn 的结合在很大程度上影响着Fc融合蛋白或者抗体在血浆中的半衰期。通过蛋白工程突变Fc 区域来调节与FcRn 的相互作用是改善治疗性单抗药代动力学的一种方法。对IgG1-N434A 突变体在食蟹猴体内研究表明，在pH6 的条件下，其与FcRn 的结合明显提高，而在pH7 的条件下无明显变化[35]。有多项研究表明，人为进行Fc 区域工程化改造，可以为提高治疗性单抗的作用提供一种新的方式。

5 Fc 改造抗体的临床应用及发展前景

目前，临床上和已上市的抗体药物中，有越来越多实例通过糖基化改造和Fc 工程改造来增加ADCC、ADCP 及CDC 等的作用，并且有直接的证据证明，通过提高这些作用能够使患者临床受益。Margetuximab 是由MacroGenics 公司开发的靶向Her2 的嵌合抗体。Margetuximab 通过改造Fc 区域的F243L/R292P/ Y 300L/L235V/P396L 五个位点，提高对FcγRIIIa 的结合能力（FcγRIIIa-158V 和FcγRIIIa-158F 的结合能力都提高）并降低对于FcγRIIa 的结合能力，以此来提高ADCC 效应。Margetuximab的III 期临床研究结果公布，成功的证明了增强ADCC 效应确实可以改善靶向抗体肿瘤治疗[46]。由礼来公司研发的度拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂（RA），这是糖尿病药物中备受瞩目的一类药物，其分子构成属于Fc 融合蛋白，由GLP-1、连结肽及IgG4 Fc 构成，其Fc 改造突变位点为S228P、E234A、F235A。对于IgG4-Fc 的改造，其原理已经非常清楚，S228P 可以避免IgG4 的Fab exchange 效应，E234A、F235A 则通过突变降低与FcγR 的结合，进一步去除ADCC 效应。该药物的研发成功能够更好地帮助2 型糖尿病患者达到血糖控制目标[47]。有研究通过噬菌体展示Fc 变体文库的筛选鉴定了在pH6.0 下具有增强的与人FcRn的结合的突变体YTE（M252Y/S254T/T256E）[48]。Motavizumab-YTE 作为一种靶向呼吸道合胞病毒的人源化抗体，通过Fc 改造设计提高FcRn 结合亲和力以提高抗体的半衰期，该抗体已进行一期临床试验，结果显示比Motavizumab IgG1 的半衰期增加2到4 倍[49]。百济神州研究的Tislelizumab（替雷利珠单抗）是一种靶向于程序性死亡受体1（PD-1）的IgG4 型单克隆抗体，能与T 细胞表面阻碍免疫激活的重要受体PD-1 结合，抑制PD-1，并清除癌细胞激活免疫系统的阻碍因素，从而恢复T 细胞的肿瘤杀伤能力。此药研发正是通过Fc 段改造而与目前已获批的PD-1 抗体存在潜在的区别。根据临床前数据，这Fc段的改造可最大限度地减少与其他免疫细胞潜在的负面相互作用[50]。

表1 Fc 区域工程改造实例Tab. 1 Examples of Fc sequence engineering for a desired function

到目前为止，已经报道了Fc 工程改造在改善治疗性单抗或融合蛋白方面所做的一些努力。这些改构抗体的治疗效果同野生型抗体或融合蛋白相比，已经有了显著的临床效果，而且被认为是有效的治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症和感染最有效的药物之一。因此，通过工程改造实现差异化来显示自身优势以势在必行，相信在以后的研发中，治疗性单抗将存在越来越激烈的竞争，也将为人类疾病的治疗提供一种新的手段。

综上所述，随着现代医药技术的快速发展，人类基因功能研究的不断深入，新的药物靶标会越来越多，对靶标的功能和结构认识也越来越完善，抗体药物也随着生命科学的进步克服现在面临的一系列问题，从而获得更大的发展空间。利用抗体工程研制更有效的治疗性抗体的前景非常光明。新型抗体工程技术的不断出现，将为抗体改造提供了强有力的技术平台。相信不久的将来，治疗性抗体会在人类疾病的治疗中扮演重要的角色。