刚地弓形虫肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白家族的研究进展

李润花，李雅清，殷国荣

肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)/丝切蛋白(cofilin)家族是一类肌动蛋白结合蛋白，广泛存在于真核细胞中。迄今为止，已经发现多种肌动蛋白结合蛋白，其中ADF/cofilin(AC)被认为有着重要作用。1980年，Bamburg等首次从鸡胚的脑组织中发现并提纯出AC蛋白[1]。AC蛋白是调节微丝翻转必不可少的纤维状肌动蛋白(Fibros-actin，F-actin)与球形肌动蛋白(Globular-actin，G-actin)结合蛋白。Cofilin主要通过切断肌动蛋白丝(actin filaments，AF)来增加肌动蛋白解聚作用，而ADF则通过螯合ATP-肌动蛋白单体从而促进F-actin向G-actin的转换来维持动力。两者在重塑肌动蛋白骨架中起重要作用，其中一种蛋白的缺失可由另一种蛋白来弥补[2]。寄生性原生侵入宿主细胞与肌动蛋白骨架重塑密切相关[3]。疟原虫生活周期的转化、克氏锥虫侵入宿主、侵袭性阿米巴的脱囊、刚地弓形虫速殖子滑动以及利什曼原虫的发育在一定程度上均与AC蛋白的含量成正相关[4-6]。

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)属于顶端复合门，是一种专性胞内寄生虫，可感染侵入大多数温血动物宿主的有核细胞。顶端复合门寄生原虫是以依赖于肌动蛋白丝的滑行运动(gliding motility)为基础穿越生物屏障侵入宿主细胞，而滑行运动是刚地弓形虫侵入细胞的独特运动形式[3]。寄生虫在滑动时肌动蛋白丝快速组装和翻转，以提供其侵入的动力。然而到目前为止，寄生虫滑行所依赖的微丝翻转特性尚未得到充分的解释。有研究表明，弓形虫侵入宿主细胞时，98%的肌动蛋白为球形肌动蛋白(G-actin)，即肌动蛋白单体维持其运动状态。弓形虫肌动蛋白解聚因子(TgADF)通过调节弓形虫肌动蛋白动力学，从而在其侵入宿主中发挥重要作用，可抑制TgADF可阻止弓形虫持久的滑行运动，降低其侵入宿主的移动速度。近年来，通过基因重组构建TgADF重组体成为弓形虫疫苗候选抗原的研究方向[7]。

1 AC蛋白家族的结构特点

AC蛋白家族主要包括ADF、cofilin1和cofilin2，虽然他们的氨基酸数量及序列不尽相同，但其蛋白质高级结构相似性很大[1]。这是由于ADF/cofilin基因的外显子与内含子交界区序列在不同物种间高度保守，通过选择性剪接对其进行转录后调控，最终产生相同的多肽[8]。AC蛋白家族的大小从113个氨基酸到168个氨基酸不等。ADF具有一个相当保守的长α-螺旋，可与肌动蛋白结合并促使其解聚，称为ADF同源区(ADF-H)。ADF-H也存在于在其他的肌动蛋白结合蛋白中，如肌动蛋白结合蛋白1(actin binding protein 1，ABP1)、肌连脑蛋白、双丝蛋白等。此外，ADF具有一段Trp100/Met115序列，可结合磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)，在ADF与肌动蛋白的相互作用过程中十分重要。然而有研究证实，刚地弓形虫ADF(TgADF)不与PIP2结合，因而PIP2并不能影响TgADF与G-actin的相互作用[9]。真核生物AC蛋白家族是一类低分子量肌动蛋白调节蛋白。单细胞真核生物仅含有一个或两个AC蛋白，而多细胞有机体，如小鼠含有多个AC蛋白[10]。TgADF含有118个氨基酸，与其他低分子量肌动蛋白单体分离蛋白具有高度同源性，如阿米巴属的载肌动蛋白、植物ADF、酵母及脊椎动物丝切蛋白。

通过Southern blot检测表明，TgADF由一段单拷贝基因编码，属于功能亚型的AC蛋白。通过免疫荧光及免疫电镜技术发现TgADF主要定位于速殖子质膜下，散落存在于胞浆内[11]。与其他生物的ADF相比，TgADF氨基酸序列最短，由于缺乏与F-actin结合相关的C端螺旋，而具有低F-actin切断、高G-actin螯合活性。TgADF含有一段保守的AC蛋白折叠区，此区域由中央的6个β-折叠，周围包绕3个α-螺旋和一个C端卷曲组成。在结构和动力学上，G-actin和TgADF表面结合的G-actin之间的相互作用，在很大程度上决定了TgADF的高G-actin螯合活性。TgADF的G-actin结合位点构象的灵活性直接决定了TgADF与G-actin的亲和力。有研究发现，TgADF和兔肌肉G-actin之间相互作用的平衡解离常数只有23.81nM，显示出TgADF与G-actin的高亲和力[9]。

2 AC蛋白活性的调节

肌动蛋白丝的解聚和聚合动力学及其骨架重塑成为细胞迁移、粘附、分化等必不可少的因素。AC蛋白可促进肌动蛋白丝解聚分离，在肌动蛋白丝快速翻转和依赖肌动蛋白的细胞骨架重塑过程中扮演重要角色[12]。AC蛋白活性受细胞内外信号分子及其自身磷酸化与去磷酸化调节。AC蛋白磷酸化酶在肌动蛋白丝动力学中起重要作用，其靶位一般是N末端的Ser-3残基[13]。Ser-3残基磷酸化可抑制AC蛋白活性而脱磷酸化可恢复其活性。细胞中存在一系列分子调控AC蛋白磷酸化与去磷酸化，从而调控肌动蛋白骨架重塑。AC蛋白的脱磷酸化依赖于AC蛋白的磷酸酶(SSH)。目前为止，至少有3种蛋白激酶参与调控AC蛋白的磷酸化过程。有研究证实，LIM结构域蛋白激酶1和2(LIMK1和LIMK2)可磷酸化AC蛋白Ser-3位点[14-15]。Rho家族小G蛋白Rac、Rho、Cdc42均可活化LIM激酶[16-17]，由下游效应分子p21激酶和Rho相关激酶介导，分别磷酸化LIMK1的508位和LIMK2的505位苏氨酸[18]。而热休克蛋白90(HSP90)可通过二聚化和磷酸转移途径调控LIMKs水平。同时泛素连接酶Rnf6可降解LIMKs。睾丸特异性激酶1(TESK1)是一种丝苏氨酸激酶，N末端含一个蛋白激酶区，C末端是一个富含脯氨酸域[19]。TESK1和LMK类似，可磷酸化AC蛋白Ser-3位点，诱导肌动蛋白张力纤维形成[20]。不同的是，TESK1的活性由整联蛋白介导的信号通路调控，并不是p21激酶和Rho相关激酶[20]。

依赖LIMKs、TESKs调节AC蛋白活性在弓形虫尚未见报道。而刚地弓形虫脱氧核糖磷酸醛缩样酶(TgDPA)被发现可提高TgADF蛋白活性。通过免疫共沉淀和GST-速冷点法测定TgDPA和TgADF的相互作用，发现加入GST-TgDPA可降低肌动蛋白聚合度、加速肌动蛋白丝解聚。AC蛋白对于肌动蛋白的聚合及解聚活性也依赖于pH调节[21]，这一点在刚地弓形虫和人均有报道[11,21]。ADF对pH的依赖性要高于丝切蛋白，一般而言，在低pH环境下可以增强AC蛋白稳定肌动蛋白的能力，pH<7.1时可抑制AC蛋白对肌动蛋白的解聚作用，pH升高时可快速解聚肌动蛋白、增强其与肌动蛋白单体结合的能力。研究发现，小鼠胚胎成纤维细胞胞浆内pH从7.4降到6.6时，ADF含量从42%降至23%[22]。然而不同生物体AC蛋白的pH依赖性并不一致，如阿米巴属的载肌动蛋白和酵母丝切蛋白均不受pH影响。此外，还原剂谷胱甘肽可使cofilin二聚化而失去解聚活性[23]，如T细胞cofilin，因其半胱氨酸位点被谷胱甘肽氧化形成分子内二硫键而失去解聚活性，从而增加了肌动蛋白丝的水平[24]。

3 AC蛋白参与调控肌动蛋白动力学机制

AC蛋白可增强肌动蛋白丝翻转因而被称为肌动蛋白动力学蛋白。AC蛋白对肌动蛋白的动力学影响及调控机制复杂多样，不仅与肌动蛋白丝而且与球状肌动蛋白结合，既可促进肌动蛋白聚合也可促进肌动蛋白丝解聚[25-26]。Roland等[27]建立的肌动蛋白动力学模型表明，AC蛋白通过两方面发挥解聚活性，一是切断肌动蛋白丝，二是增强肌动蛋白单体离开肌动蛋白丝末的速率。AC蛋白与沿着长螺距螺旋的肌动蛋白亚单位相互作用，解聚肌动蛋白丝还是聚合肌动蛋白取决于AC蛋白与肌动蛋白的摩尔比。当肌动蛋白丝中AC蛋白与肌动蛋白比<1∶100时，肌动蛋白丝持续切割而解聚；比例上升至1∶10到1∶2时，肌动蛋白丝短暂切割而使其稳定在一种扭曲状态；比例继续上升，当AC蛋白过量时，肌动蛋白不再被切割而维持聚合状态。研究发现，当丝切蛋白浓度很高时，可促进肌动蛋白单体聚合、核酸合成以及肌动蛋白组装[28]。

与其他真核生物不同，顶端复合门寄生虫的AC蛋白家族成员缺乏F-actin结合位点，但其仍旧可以促进肌动蛋白丝分解[3]。重建C端F-actin结合位点反而降低网状微丝的解聚活性。通过免疫荧光和电子显微镜技术发现，抑制TgADF可导致肌动蛋白丝累积，从而降低弓形虫移动速度、增加异常移动形式、抑制持久的滑行运动。TgADF是一种弱切割蛋白，需要更高的浓度才可以达到诸如其他AC蛋白解聚肌动蛋白的效应。但同时，由于TgADF的强肌动蛋白单体螯合活性，在极低浓度时即可抑制弓形虫肌动蛋白的聚合。TgADF与G-actin结合，降低G-actin的浓度，促使F-actin向G-actin的转变，从而加速肌动蛋白丝解聚翻转。在高浓度G-actin环境下，TgADF的作用尤为明显。

4 AC蛋白作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性

AC蛋白家族通过调节微丝翻转重塑细胞骨架，从而影响细胞生长、发育和分化。家族成员ADF在寄生虫运动、粘附及入侵宿主过程中起重要作用，因此其成为许多寄生虫疾病候选疫苗研究的热点[29]。早在1997年Allen等[11]就已经克隆表达出刚地弓形虫ADF，研究了TgADF与调控肌动蛋白解聚的关系，并提出抑制TgADF阻遏弓形虫入侵宿主的可能。随后，通过重组刚地弓形虫ADF免疫小鼠观察其免疫保护性的研究越来越多。2009年黄祥盛[30]构建pET28a(+)-TgADF重组质粒和重组ADF蛋白分别免疫小鼠，通过检测T细胞数量和脑内虫荷研究弓形虫ADF的免疫保护性。2011年Li等[7]用pVAX1-TgADF重组质粒免疫小鼠，脑内减虫率达42.8%。TgADF作为弓形虫疫苗候选抗原成为了可能，在抗弓形虫感染中具有一定的作用。

综上所述，随着结构生物学及体外分析等各种技术的发展与应用，对AC蛋白家族的结构、氨基酸序列、功能、信号转导通路等各个方面的研究越来越深入。对于刚地弓形虫而言，ADF是其侵入宿主细胞过程必不可少的因素。研究AC蛋白家族作为疫苗候选抗原具有潜在的价值。

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