高酮体乳的蛋白热稳定性研究

陈芮，彭鑫，吴雨薇，周青，温富勇，王天坤，毛学英

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

0 引 言

奶牛酮病又称酮血症、酮尿症，是碳水化合物及脂肪代谢紊乱所引起的一种营养代谢性疾病。酮病的发生与奶牛能量负平衡及体脂动员有关，会引起体组织和乳中酮体含量的升高[1]。一般认为当成年奶牛血液中β-羟丁酸浓度≥1.2 mmol/L时为亚临床性酮病，当β-羟丁酸浓度＞3.0 mmol/L时为临床性酮病[2-3]。酮病的发生导致奶产量大幅度降低、乳质变差、乳成分改变、繁殖率降低及淘汰率升高等问题[4-5]。

在患酮病时，奶牛的平均产奶量显著降低，且患酮病牛乳的成分较未发生酮病时会发生明显变化。奶牛酮体升高时，牛乳非脂乳固体减少0.28%，乳糖和矿物质降低0.19%，蛋白质含量降低0.09%[5-6]，牛乳脂肪和蛋白的比值明显升高[7-8]。Kayano等人通过T-检验和回归分析研究了酮病对奶牛产奶量和乳成分的影响，发现酮病会导致产奶量下降和脂肪与蛋白质的比值升高[9]。

奶牛酮病是一种在牧场中较为常见的营养代谢性疾病，目前国内外关于酮病的研究多限于对酮病的预防和治疗等，缺乏关于高酮体乳与正常乳营养成分差异的全面系统性评价，且尚未见关于高酮体乳加工特性的研究。因此，为了更好地探究高酮体乳的加工特性，本文探究了不同酮体浓度的牛奶热稳定性，为牧场的生产管理和乳品加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常乳（normal milk，NM）和高酮体乳（high ketone milk,HKM）取自北京密云河南寨牧场。5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠（SDS）、β-巯基乙醇（β-ME）、溴酚蓝、四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝等为超级纯。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

BS124s分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；L2102电子天平，伯拉莫贝林（上海）；UV-2600紫外-可见分光光度计，尤尼克（上海）仪器有限公司；pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；552BR电泳仪，Bio-RAD；RF-5301PC荧光分光光度计，日本岛津有限公司；DSHZ-300A恒温水浴振荡器，江苏太仓实验设备厂；TG16W高速台式离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；QL-861漩涡振荡器，海门市其林贝尔实验设备制造有限公司；SC-3612低速离心机，安徽中科佳科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

取正常乳（NM）和高酮体乳(HKM，酮体含量1.6 mmol/L)，向两种乳中添加质量浓度0.02%的叠氮化钠，置于4℃保存。

将正常乳和高酮体乳分装至试管中，每管4 mL。分别在65、75、85、95 °C下加热10 min。取出后立即冰浴2 min，恢复至室温。

1.3.2 SDS-PAGE电泳

根据Emmanulled的方法并稍加改动[10]。样品用去离子水稀释后，与一定体积的样品缓冲液混匀后，沸水浴5 min，冷却后摇匀上样10 μL。样品缓冲液分别是SDS还原缓冲液（质量分数10%的SDS，浓度为14.4 mol/L的β-巯基乙醇，质量分数25%甘油，0.1%溴酚蓝，浓度为 60 mmol/L的 Tris-HCl，pH值 为6.8）和SDS非还原缓冲液（同上，不含巯基乙醇）。分离胶质量分数为12.5%，浓缩胶质量分数5%。考马斯亮蓝染色后脱色到背景色很淡为止，用Canon扫描仪扫描。

1.3.3 乳清蛋白变性程度

参考Leighton的方法，并稍作改变[11]。取经热处理后的牛乳5 mL，每管中加入2 g NaCl，37°C水浴加热30 min（前15 min以100 r/min的速度震荡，后15 min静置）。然后取出，趁热过滤到10 mL离心管中。取1.8 mL滤液于另一个离心管中，加入4 mL饱和NaCl溶液混合制成滤液盐，倒置盖塞振摇，而后加入5滴10%的HCl，静置10 min，以不加滤液的盐溶液做空白，420 nm处测吸光值。每个样品做三个平行。

1.3.4 巯基含量

根据Beveridge et al的方法并稍作修改，测定乳的巯基含量[12]。取1 mL样液＋5 mL缓冲液I＋0.04 mL Ellman试剂于10 mL离心管中，混充分匀后置于25°C恒温保持10 min。然后取约2～3 mL样品置于玻璃比色皿中，采用分光光度计测定样品在412 nm处的吸光值。不加样液时作为空白调吸光度为0。

巯基含量按照公式进行计算：

式中：A412—样品在412 nm处的吸光值

D—稀释倍数D=6.04×2=12.08

C—样品固形物含量mg/mL

1.3.5 表面疏水性

根据Alizadeh-Pasdar and Li-Chan的方法并稍作修改[13]。样品热处理后用pH值为7.0浓度为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释，使样品液的蛋白质量分数为0.0025%～0.0125%。取1 mL上述稀释蛋白液，加入4 mL水稀释，漩涡振荡，充分混匀。加入ANS后混匀避光静置10 min，然后用荧光分光光度计下分析，激发波长390 nm，发射波长470 nm左右测定荧光强度F1，同时测定不加ANS探针时的内源性荧光强度F0。以蛋白质量分数为横坐标，相对荧光强度（F1与F0的差值）为纵坐标，得到曲线的初始斜率即为表面疏水性。

2 结果分析与讨论

2.1 正常乳和高酮体乳的蛋白电泳图谱分析

未经热处理的正常生乳和高酮体生乳的非还原电泳图谱如图1所示。

图1 正常乳和高酮体乳的电泳图谱

从电泳图来看，在上样量相同时，高酮体乳的β-CN、κ-CN、α-LA条带颜色更深，宽度更宽，说明高酮体乳的β-CN、κ-CN、α-LA比例高于正常牛乳。而对α-CN、LF、BSA，两种乳之间的条带并不存在肉眼可见的差异。

2.2 热处理对乳清蛋白变性程度的影响

经过65，75，85，95 °C分别热处理10 min后，乳清蛋白变性程度结果如图2示。

图2 不同温度下乳的乳清蛋白变性程度（*P<0.05）

根据乳清蛋白氮指数原理，OD420可表征乳清蛋白变性程度，OD值越高，蛋白变性程度越低。对比两组乳样可知，在加热温度到达65°C时，两组乳的OD值略有增加，可能是温度升高促进了蛋白溶解所致。在温度不高于75°C时，未变性乳清含量并未发生明显变化，乳蛋白均未发生明显的热变性。当温度达到85°C和95°C时，乳样的吸光值均显著下降，说明样品中的蛋白都发生了一定程度的变性，且正常乳的OD值显著高于高酮体乳，说明正常乳的变性程度显著低于高酮体乳。随着热处理强度的进一步增强，OD值逐渐减小，说明未变性乳清蛋白的含量显著减少。乳清蛋白在热处理过程中暴露活性巯基，活性巯基通过二硫键形成小聚集体，当热处理强度进一步增加时，小聚集物通过二硫键和疏水相互作用结合形成较大的聚集体。在加热过程中（85°C、95°C），正常乳呈现出更好的热稳定性。

2.3 热处理对乳蛋白表面巯基含量的影响

样品经65，75，85，95 °C分别热处理10 min后，样品表面巯基变化如图3所示。

图3 不同温度下的表面巯基含量（*P<0.05）

样品经65°C热处理10 min与25°C热处理10 min的样品相比，表面巯基没有明显变化。当热处理强度增强至75°C时，高酮体乳的表面巯基含量明显升高，并在95°C时达到最大，且显著高于25°C时的表面巯基含量。将高酮体乳与正常牛乳的表面巯基对比，发现温度达到85°C时，高酮体乳和正常牛乳的表面巯基显著增加，且高酮体乳的表面巯基含量高于正常牛乳。当温度达到95°C时，两种原料的表面巯基含量进一步增大，蛋白质变性程度增加。综上分析可知，高酮体乳蛋白热稳定性较正常牛乳差。高温处理时，β-LG变性，分子链展开，内部隐藏的巯基暴露，表面巯基含量增加[14]。

2.4 热处理对乳蛋白表面疏水性的影响

样品经65，75，85，95 °C分别热处理10 min后，乳蛋白疏水性变化如图4所示。

总体来看，乳蛋白的疏水性均随温度升高而升高，且在95°C时达到最高。在加热温度为75°C、85°C、95°C时，高酮体乳蛋白的表面疏水性均显著大于正常牛乳，说明在高温处理下，高酮体乳蛋白发生了更为显著的变性。温度升高会使乳中的疏水性位点增加，在85°C和95°C下，乳蛋白发生发生比较显著的变性，疏水性位点也逐渐增加。蛋白间的疏水相互作用与蛋白的二级结构和三级结构有紧密联系，疏水性互作用降低，则说明蛋白分子的二三级结构水平较高[15]。

图4 不同温度下乳的表面疏水性（*P<0.05）

2.5 乳蛋白SDS-PAGE电泳图谱随加热强度的变化

对不同热处理的高酮体乳和正常牛乳进行电泳分析，结果如图5所示。

图5 不同温度下的正常乳与高酮体乳电泳图

在非还原条件下，发现对于高酮体乳来说，当加热温度为65°C时，乳清蛋白条带开始变浅，说明此时部分乳清蛋白发生了变性，但还没有明显的聚集物产生；当热处理温度升至75°C时，加样孔中开始有聚集物出现，同时酪蛋白条带变浅、乳清蛋白尤其是α-乳白蛋白条带变浅，且随着温度的继续升高，程度加剧；当加热温度达到95°C时，酪蛋白条带和乳清蛋白条带明显变浅，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白条带几乎完全消失；这说明当温度达到75°C及以上时，乳清蛋白自身或酪蛋白与乳清蛋白之间发生交联，形成明显的聚集物。

还原条件下，加入β-巯基乙醇还原二硫键后，65°C、75°C热处理样品的加样孔蛋白聚集物完全消失，且乳清蛋白条带及酪蛋白条带恢复至与25°C处理样品相当的水平；热处理温度为85°C的样品加样孔蛋白聚集物完全消失，但乳清蛋白（尤其是α-乳白蛋白）条带稍浅；热处理温度为95°C的样品加样孔中仍有聚集物，且乳清蛋白（尤其是α-乳白蛋白）条带也比25°C样品浅。这说明对于两种乳来说，热处理过程中，蛋白主要通过二硫键作用形成聚合物，但当温度较高（85°C、95°C）时，蛋白的聚集可能有其他作用力的参与，如疏水相互作用等。从电泳结果来看，高酮体乳的热稳定性更差。

3 结 论

两种乳在75°C～95°C处理下下均发生一定程度的变性，在温度达到75°C时，高酮体乳已经发生变性，电泳加样孔中出现少许聚集物，而正常牛乳未发生明显变性。在温度达到85°C和95°C时，两种乳均发生明显变性，但是高酮体乳的变性程度更高，热稳定性更差。