高效液相色谱法测定马乳中维生素C的质量浓度

聂昌宏，古丽巴哈尔·卡吾力，郑欣，阿依居来克·卡得尔，高晓黎

（新疆医科大学药学院,乌鲁木齐830011）

0 引 言

维生素C又称为抗坏血酸，具有抗坏血病的作用。婴儿配方奶粉是婴儿重要的维生素C来源，一旦缺乏维生素C，则会引起孩子幼年期坏血病的发生[1]，因此维生素C也是配方奶粉中需要强化的指标之一[2]。

研究证明，马乳和马乳制品有丰富的营养价值，维生素C含量较高，是最佳食品之一[3]。

常见的维生素C检测方法有：2,4—二硝基苯肼比色法[4]、紫外分光光度法[5]、碘量法[6]、2,6—二氯靛酚法等[7]。这些方法特异性较差，容易产生误差。高效液相色谱法样品预处理简单、分离度高、分析时间短。本研究旨在建立一种快速检测乳品中维生素C的高效液相色谱法，并运用于各种乳中维生素C含量的测定，进而对不同乳中维生素C含量及不同季节马乳中维生素C含量进行比较。

1 实验

1.1 仪器设备

Agilent 1220型高效液相色谱仪，AB135-S型分析天平，KQ5200DE型数控超声波清洗器，Sigma3-K30型高速台式冷冻型离心机，PS-1000型EYELA磁力搅拌恒温油槽。

1.2 材料与试剂

偏磷酸（分析纯），维生素C对照品（HPLC≥98%），马乳粉（由鲜马乳直接冷冻干燥制得）；鲜马乳，鲜牛乳，鲜驼乳。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为SupersilAQ-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为0.125%偏磷酸溶液，流速为0.8 mL/min，检测坡长为245 nm，进样量为10 μL，检测器为紫外检测器。

1.3.2 溶液配制

（1）流动相用偏磷酸溶液（0.125%）：取适量偏磷酸块状固体敲打研磨至粉末状，精密称取3.57 g于烧杯中，加入适量超纯水，用磁力搅拌器在85℃热水浴中搅拌，溶解后放冷至室温，转移至1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，以0.22 μm水系滤膜滤过，超声10 min，待用。

（2）提取试剂用偏磷酸溶液（3%）：精密称取上述偏磷酸粉末17.14 g于烧杯中，加适量超纯水，用磁力搅拌器在85℃热水浴中搅拌，溶解后放冷至室温，转移至200 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得。

1.3.3 维生素C对照品的配制

精密称取3.2 mg维生素C对照品于10 mL棕色容量瓶中，用3%偏磷酸溶液配制成质量浓度0.32 mg/mL的储备液定容，倍量稀释成160，80，40，20，10，5，2.5 μg/mL系列质量浓度对照品溶液，现用现配。

1.3.4 样品处理

称取0.4 g马乳粉（液体乳2 g）于10 mL的棕色容量瓶中，加入3%偏磷酸溶液摇匀，定容，超声10 min，于10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液经0.22 μm水系滤膜过滤，滤液待上机检测。

1.3.4 系统适用性验证

分别取对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，理论塔板数按照维生素C计算应不低于5 000。待测成分与相邻峰之间分离度，拖尾因子需满足测定需要。

分别取空白溶液1（0.125%偏磷酸）、空白溶液2（3%偏磷酸）、维生素C对照品溶液、样品溶液在上述色谱条件下分析。

1.3.6 线性范围

在上述色谱条件下，以1.3.3项下对照品溶液质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。

1.3.7 精密度

取同一供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次，计算维生素C色谱峰峰面积的RSD，评价仪器精密度。

1.3.8 重复性

取同一批样品，按照1.3.4项下的方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下，进样分析，计算马乳粉中维生素C含量的RSD。

1.3.9 稳定性

1）单一土地利用动态度，定量描述了区域一定时间范围内某种土地利用类型变化的速度［10］，其值越大，说明区域土地利用变化越剧烈，反之变化越弱。图1为巢湖流域单一土地利用动态变化图。

取同一供试品溶液，4℃及室温下放置，分别于0，1，2，4，6，8 h；在上述色谱条件下，进样分析，计算8 h维生素C色谱峰峰面积变化程度。

1.3.10 准确度

称取对照品2.19 mg于25 mL容量瓶中，用3%偏磷酸定容。称取已知含量的同批马乳粉样品9份，每份约0.2 g，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，加3%偏磷酸溶液适量，使乳粉分散均匀，分别吸取上述对照品储备液0.5，1，1.5 mL加入样品容量瓶中，超声10 min，用3%偏磷酸定容，制成高、中、低三个浓度的供试品溶液，每个浓度3份，于10 000 r/min转速下离心10 min，取上清液经0.22 μm水系滤膜过滤，滤液上机检测，回收率为

1.3.11 样品检测

（1）不同季节马乳中维生素C含量的测定：分别于4月、7月、12月从新疆伊犁新源县各采集10个鲜马乳样品，马乳采集后迅速降温处理，-20℃保存，运至实验基地，实验前，先将样品放置4℃缓慢融化，后于室温下完全溶解，按照1.3.4的方法进行处理，进样，按照1.3.1条件上机检测，外标法定量。

（2）不同乳中维生素C含量的测定：分别取鲜马乳、鲜牛乳、鲜驼乳的常乳样本在1.3.4的方法下进行操作，每个样平行操作两次，按照1.3.1条件上机检测，外标法定量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相比例的选择

本研究比较了0.25%和0.125%两种浓度的偏磷酸作为流动相，有学者采用0.25%的偏磷酸作为流动相[8]，结果发现，较低浓度的偏磷酸也完全能够达到检测要求。本课题选择较低浓度的偏磷酸作为流动相能够减少对色谱柱的消耗；偏磷酸相较于其他试剂，具有一定的粘性，降低其浓度，可以减少其在色谱柱中的残留。

2.1.2 流速的选择

本研究比较了0.6，0.8，1 mL/min三种流速，结果发现，降低流速会使出峰时间后移、分析时间延长；本文柱温较低，如果选用较高流速，会明显增高柱压，本研究选择0.8 mL/min的流速具有良好的分离效果，且保留时间适中。

2.2 样品前处理方法的选择

由于维生素C为水溶性物质，故不宜使用经典有机试剂提取法。实验前期比较了浓度为0.1 mol/L盐酸提取法、调节pH法、偏磷酸的除蛋白法后发现，前两种处理方法经离心后上清液仍然较为浑浊，很难通过微孔滤膜；使用3%的偏磷酸作为蛋白沉淀剂，离心后能够轻易通过微孔滤膜，上清液清澈，达到进样要求。

2.3 系统适用性及专属性实验

系统适用性试验结果显示，色谱峰理论塔板数大于10 000，分离度大于1.5，拖尾因子符合规定；专属性实验结果显示，对照品和供试品维生素C目标峰出峰时间一致，且周围无测定干扰，如图1所示。

图1 实验结果2.4线性和范围

在上述色谱条件下，以对照溶液质量浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得出线性方程为y=730 547.73x-775 998.67；r=0.9999，VC质量浓度和峰面积在2.5～160 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度

精密度实验计算维生素C色谱峰峰面积的RSD为0.73%，结果表明，仪器精密度良好，见表1。

表1 精密度实验结果

2.6 重复性

重复性实验显示，6份供试品溶液测得维生素C中RSD为1.10%，表明实验重复性良好，见表2。

表2 重复性实验结果

2.7 稳定性

稳定性试验结果显示，4℃下样品8 h内含量的RSD值为1.92%，室温下样品8 h内含量的RSD值为3.58%，表明该方法在两种条件下稳定性均可，但在4℃条件下测定稳定性更好，结果见表3。

表3 稳定性实验结果

2.8 准确度

回收率实验结果显示，高、中、低三个水平的加标回收率在95.8%～97.6%范围内，相对标准偏差在1.03%～1.56%之间。表明该方法准确度良好。结果见表4。

表4 加标回收率实验

2.9 不同泌乳期马乳中维生素C含量的测定

维生素C含量测定结果如表5所示。

表5 不同季节马乳中维生素C质量分数 μg/g

由表5可以看出，夏季和冬季马乳中维生素C平均质量分数比春季高。夏季平均质量分数比春季高75.42%，冬季平均质量分数比春季高78.88%。夏季马匹主要以放牧的饲养方式为主，此时牧草正处于抽茎开花时期，营养价值较高，马匹能够从牧场获得较为充分的牧草营养，有助于马匹的生长发育；冬季马匹主要以圈养方式为主，以饲料和夏季打收的牧草为食，该阶段天气转凉，马乳中成分含量可能会受到温度变化的影响；春季在新疆伊犁，马匹需要经过长达5～6个月漫长冬季，身体较为虚弱，此阶段牧草正处于萌发期，营养相对不足，且春季是马匹集中产驹的季节，此时所采马乳多为马初乳，马匹在此时的生理状态可能也是导致其马乳中维生素C质量分数相对较低的原因。

2.10 不同乳中维生素C含量的比较

维生素C含量测定结果如表6所示。

表6 不同乳中维生素C质量分数 μg/g

由表6可以看出，与表5马常乳相比较，鲜牛乳和鲜驼乳中维生素C的含量远不及鲜马乳，马乳中维生素C含量相当于鲜牛乳的68倍，相当于鲜驼乳的35倍。马奶对于草原上的人来说意义深远，饮用马奶可以维持人体维生素的平衡，以免因为缺乏维生素C而导致坏血病的发生。有文献记载，维生素C除了具有抗坏血病的作用，同时还具有抗氧化[9]，抗肿瘤[10]，免疫调节[11]等作用，马乳中丰富的维生素C使其成为应用价值较高的乳品。

3 结 论

本文建立了一种检测乳品中维生素C含量的快速检测方法，并对不同季节伊犁马马乳中维生素C含量以及不同乳中维生素C含量进行了比较。该方法在2.5～160 μg/mL质量浓度范围内具有良好的线性，线性相关系数r=0.9999；高、中、低三个浓度水平的加标回收率在95.8%～97.6%范围内，相对标准偏差在1.03%～1.56%之间。该方法简便、迅速；流动相不使用有机试剂，相对更为环保；方法适用广泛，对鲜牛乳和鲜驼乳同样适用。在不同季节马乳的比较中，夏季和冬季的马乳维生素C含量相对春季明显更高；不同乳的比较中，马乳中的维生素C含量明显高于鲜牛乳和鲜驼乳。