灵芝原生质体单核菌株的制备及形态特性比较

丛倩倩 崔 晓 王庆武

（泰安市农业科学研究院，山东泰安271000）

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种珍贵的药用真菌，含有多糖、三萜等多种有效活性成分，具有抗肿瘤、护肝、提高免疫力、美容养生、延年益寿等多种功效，是一种理想的保健食品[1-2]。

近年来，我国灵芝栽培、深加工业得到迅速发展，市场规模逐步扩大，灵芝产业已成为我国最重要的食药用菌产业，因此灵芝优良品种的选育尤为重要。杂交育种是食用菌新品种选育中使用最广、收效最显著的手段，其基本育种材料是单核体。单核体常规的是从担孢子中分离单个孢子获得，但是灵芝孢子人工条件下很难萌发，无法通过常规的单孢分离技术进行杂交育种。1989年，Peberdy在研究丝状真菌原生质体制备和再生时，发现菌丝体的原生质体中含有三种类型，即无核、单核、双核原生质体[3]。随后，潘迎捷等发现单核原生质体是异宗结合食用菌原生质体中的一个普遍现象[4]，利用这一现象可以从菌丝体中直接得到单核体，而不受出菇和孢子的限制[5]。因此可以通过原生质体单核化来获得灵芝杂交育种材料。

研究以3个灵芝菌株为供试材料，分别制备其原生质体，并从中筛选单核菌株，比较单核与双核、不同交配型单核菌株之间的生长特性，以期为今后灵芝单核杂交育种提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

灵芝菌株为泰山赤灵芝1号、灵芝4895、野生灵芝2，均由泰安市农业科学研究院食用菌所保存。

液体（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g。加水1 L，pH自然。液体再生培养基：麦芽糖5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，甘露醇0.6 mol/L。加水1 L，pH自然。

稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇。溶壁酶：购自广东微生物研究所，用0.6 mol/L甘露醇配成2%浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 原生质体的制备与再生

分别取供试菌株的原种菌块接入含有100 mL液体PDA培养基的250 mL三角瓶中，于25℃培养箱中静置培养7 d。菌液9600×g离心15 min，去上清，

菌丝用无菌水洗涤一次，滤纸吸干菌丝水分。称取0.5 g菌丝于5 mL离心管中，加入2 mL 2%的溶壁酶，30℃水浴2.5 h，滤去残留菌丝，0.6 mol/L甘露醇清洗2次，离心收集原生质体，用液体再生培养基适当稀释后涂布于固体再生培养基平板上，25℃静置培养72 h至长出再生菌落。

1.2.2 单核菌株的筛选

从供试菌株原生质体再生平板上挑取菌落小，生长比较缓慢的单菌落分别转接到PDA试管斜面培养基上，待菌丝长出后挑取少量菌丝镜检，无锁状联合的为单核再生菌株。

1.2.3 单核菌株交配型的确定

图1 单核菌株与其出发菌株的宏观菌落形态

每种供试菌株得到的原生质体单核菌株应具有两种不同的交配型。分别随机选取一株已经鉴定的单核菌株作为标准，然后将每种供试菌株的其他单核菌株分别与这一标准菌株进行配对，配对时，两菌株各取5 mm菌块接种于PDA平板上，相距约2 cm，大约7 d后在菌丝交接处挑取菌丝镜检，有锁状联合的证明两菌株为不同的交配型；无锁状联合的证明两菌株为相同的交配型。

1.2.4 单核菌株生长情况的测定

采用平板培养菌丝体，25℃恒温培养箱暗培养，“十字交叉”法测量菌落直径，计算菌丝长速并观察记录菌丝长势。

1.2.5 单核菌株微观形态观察

用载玻片刮取培养皿边缘菌丝制成玻片标本，在光学显微镜下先用10倍物镜找到目标，然后用40倍物镜对不同交配型单核菌丝进行形态观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 三个灵芝菌株单核菌株的得率

三个灵芝菌株原生质体单核化菌株得率见表1。由表1可以看出，TL-1单核得率最高为52.5%，其次4895为38.3%，YSL-2单核得率最低为5%。说明不同灵芝菌株单核菌株的得率是不同的，TL-1获得单核菌株的概率较高，YSL-2则较低。

表1 三个灵芝菌株单核菌株的得率及两种交配型比例

2.2 三个灵芝菌株原生质体单核菌株交配型测定

三个灵芝菌株原生质体单核菌株交配型测定结果见表1。TL-1获得了两种交配型的单核菌株，分别命名为TL-1-DH1和TL-1-DH2，两种交配型数量之比为16∶5，而4895、YSL-2均只获得了一种交配型，分别命名为4895-DH、YSL-2-DH，说明不同灵芝菌株两种交配型单核菌株的获得比例不同，TL-1比其他两个菌株较易获得两种交配型单核体。4895和YSL-2的其中一种交配型单核菌株相对较易获得，而另一种交配型单核菌株不易得到。此外还可以看出，三个菌株两种交配型单核体的分离比例均不符合1∶1的理论值。

2.3 单核菌株与其出发菌株以及不同单核菌株之间的形态特征比较

单核菌株与其出发菌株以及不同单核菌株之间的宏观、微观形态特征见图1、图2和表2。

由图1可以看出，不同单核菌株之间以及不同单核菌株与出发菌株之间菌丝长速以及菌落形态均表现出明显的差异。4种单核菌株在菌丝生长速度上与其出发菌株比，均表现出生长速度变慢的现象，且同一菌株具有两种不同交配型的单核菌株生长速度以及菌落形态也存在差异。TL-1-DH1和TL-1-DH2单核菌株其出发菌株均为TL-1，但TL-1-DH1菌丝浓密厚薄均一，边缘不整齐，长速为0.87 cm/d；TL-1-DH2的菌落中间较浓密，边缘较稀薄整齐，厚薄不一，长速为0.95 cm/d，快于TL-1-DH1，也快于4895-DH和YSL-2-DH；4895-DH气生菌丝较多，菌落中间较浓密，边缘不整齐，长速最慢为0.69 cm/d；YSL-2-DH菌丝浓密，边缘整齐且厚薄均一。

图2 四种不同交配型单核菌株菌丝的微观形态（400×）

表2 三个灵芝菌株不同交配型单核菌株菌落形态特征比较

不同交配型的单核菌丝体的微观形态见图2。由图2可以看出在光学显微镜下观察不同交配型单核菌丝体的形态也表现出明显的差异。YSL-2-DH菌丝比较密集；TL-1-DH1和TL-1-DH2菌丝生长比较规则，分支少；4895-DH菌丝生长凌乱、分支较多。

3 小结与讨论

一般来说，单核菌丝的生长速度比双核菌丝慢，在再生培养基中要尽量挑取菌落较小、生长比较缓慢的单菌落。在三个灵芝菌株原生质体再生平板上，分别挑取菌落较小、生长较慢的单菌落，均获得了单核体菌株，但是4895、YSL-2均只获得了一种交配型单核体，如果进一步加大原生质体的再生数和挑取菌落数可能会筛选到另一种交配型的单核体。

试验获得了TL-1两种交配型单核体，分离比例为16∶5，4895、YSL-2均只获得了一种交配型单核体，三个灵芝菌株两种交配型单核体的分离比例均不符合1∶1的理论值，这与吴小平、朱朝辉等的报道类似[6-7]，分析原因可能是因为两种交配型单核体的再生速度和再生能力不同，一种交配型单核体的再生速度较快、再生能力较强，在再生前期出现的菌落中出现，因此较易获得；而另一种单核体再生速度较慢、再生力较弱，在再生后期出现的菌落中由于双核菌丝的迅速生长，覆盖了再生的单核体，因此不容易挑取到。

研究中四种单核菌株的生长情况、宏观、微观菌落形态均表现出一定程度的差异，这为以后杂交育种亲本的选择提供了理论指导，但是单核菌株生长情况的好坏与其杂交后代农艺性状的好坏并不是成正相关的，单核菌株生长状况弱的，其杂交后代的农艺性状并不一定差，单核菌株生长较好的，其杂交后代的农艺性状也不一定优良，所以在以后的研究中要把这些单核菌株都作为杂交育种的材料，两两均配对杂交以增加获得优良菌株的机会。