内蒙古五个环柄菇形态学及rDNA-ITS鉴定

田慧敏 张亚男 李晓东 吕晓娜

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

环柄菇属（Lepiota）隶属担子菌门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales），伞菌科（Agaricaceae）。该属的主要特征是所有种都腐生于地上，菌盖小或中等，菌盖具鳞片，菌柄着生菌环，菌褶色浅，白色或乳白色，离生或弯生，孢子椭圆形，卵圆形，无色、光滑，类糊精质，褶侧囊体无，褶缘囊体丰富，棒状或倒梨形[1-2]。据真菌索引统计，该属真菌大约1500多种（包括变种和原变种）。近些年来，微观形态及分子生物学技术在分类学上的广泛应用，该类真菌的分类发生了很大变化，许多种如囊皮菌属Cystoderma和粘伞属Limacella一些种从其相应的属分离出来独立成属[3-4]，同时白鬼伞属Leucocoprinus、大环柄菇属Macrolepiota、白环菇属Leucoagaricus、Cystolepiota和 Echinoderma从环柄菇属分离独立成属[5-6]。这些属因其外形特征相似，同环柄菇属（Lepiota）合称环柄菇类“Lepiotoid”[7]。笔者采用形态学和ITS片段测序技术相结合的鉴定方法对赤峰市不同地区的四个有毒环柄菇类真菌进行鉴定，力求为环柄菇类快速识别提供依据，为其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试标本来源

供试标本CFSZ11339、CFSZ11379由田慧敏等于2015-2017年采集于内蒙古赤峰市翁牛特旗，CFSZ10575采集于赤峰市新城区，CFSZ11356采集于赤峰市红山区动物园。采集的标本在拍摄生境照片、观察形态、测量数据、自然干燥、编写号码、超低温冷冻等系列处理之后存放于赤峰学院生命科学院菌物本标室（CFSZ）。

1.2 形态鉴定

采用传统鉴定方法，宏观特征采用肉眼观察、游标卡尺测量等方法，测量供试样本的新鲜子实体大小、菌柄长度以及直径、菌盖直径，观察颜色。查阅文献进行检索、比对、定种；显微结构在光学显微镜（奥特BED203）下观察和测量孢子、担子、菌盖表皮、菌柄表皮菌丝形态及大小，所有数据均测量20个，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构相片，孢子测量Q1（长宽比范围）和Q2（长宽比平均值），Q2=Qa±Qsd（标准误）。

1.3 ITS鉴定

1.3.1 DNA的提取

取干子实体菌盖的一小部分研磨，称量30 mg，用基因组DNA提取试剂盒完成对基因组DNA的提取。

1.3.2 PCR扩增、纯化及测序

PCR扩增反应在PCR扩增仪（eppendorf 5331）上进行。

经引物ITS1/ITS4进行50µL体系经PCR扩增后，在1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。样品PCR扩增之后的产物用Takara胶纯化试剂盒纯化后，交由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。

图1 肉褐鳞环柄菇子实体形态及微观结构

1.3.3 ITS序列比对分析

将得到的ITS序列，通过Chromas软件拼接，在GenBank数据库中进行ITS序列的Blast比对，从检索的结果里挑选出同源性比较高的ITS序列，利用MEGA5.1软件构建系统发育树，发育树的每个分支的统计学显著性分析以最大似然法进行检验，重复次数为1000次。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定，CFSZ11379为肉褐鳞环柄菇Lepiota brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356为冠状环柄菇 Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575为红盖白环菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer，CFSZ11339 为粉褶白环菇Leucoagaricus leucothites（Vittadini）P.D.Orton。

2.1.1 肉褐鳞环柄菇LepiotabrunneoincarnataChodat&C.Martín

子实体小，菌盖直径1.6～2.4 cm，钟形，开伞后平展，白色，密被褐色或黑褐色鳞片，中部鳞片较密色深呈黑褐色，边缘有短条纹。菌褶白色，厚，较宽，有短菌褶，离生。菌肉污白色或肉色。菌柄长2.4～5.2 cm，直径0.3～0.6 cm，圆柱形，基部稍膨大，浅肉色至肉粉色，菌环位于菌柄中下部，白色或浅肉色，往往边缘变褐或变黑，菌环以下具有黑褐色颗粒状附属物（图1A、B）。

担孢子（6.5～8.4）µm×（4.3～5.8）µm，[Q1=1.29～1.70，Q2=1.59±0.16]，卵圆形，有油滴，无色，光滑，非淀粉质，类糊精质，在KOH溶液中变为锈红色（图1C、D）；担子（20～30）µm×（6～7）µm，无色，棒状，黄色颗粒状物，具四个小梗，基部未见锁状联合（图1E）；褶缘囊体（24～36）µm×（7.2～12）µm，棒状（图1F），菌盖表皮由无色菌丝组成，菌丝直径7.0～12µm，无色，膨大，丝状，分枝少（图1G），盖表鳞片由近似栅栏状排列的菌丝组成，菌丝生长常倒伏，分枝，有隔膜，无色，具棕褐色色素，末端细胞（72～247.2）µm×（9.6～14.4）µm，纺锤形，长棒状，圆柱形，顶端稍细，锁状联合缺。

该种典型特点是菌盖密被褐色鳞片，菌柄肉褐色，菌环以下密被黑褐色颗粒状附属物[8]。菌盖表皮有膨大的菌丝，菌盖鳞片由栅栏状排列的菌丝组成，菌丝具棕褐色色素，菌丝顶端稍尖，属于卵孢环柄菇组sec.Ovisporae[9]。该种在我国分布广泛，富含鹅膏毒肽、鬼笔毒肽、鹅膏肽类毒素，可致肝肾损害、呼吸循环衰竭，误食后发病危害肝肾，烦躁、抽搐、昏迷，死亡率高[10-11]。

研究标本为CFSZ11379，2016年7月31日由田慧敏、柳艳斌采自于内蒙古赤峰市，翁牛特旗五分地镇巴林桥北，西拉沐沦河北岸道边草地上。

2.1.2 冠状环柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.

子实体小，菌盖1.4～2.5 cm，近钟形，后平展，乳白色，中央凸起，具浅棕色、红棕色或黄褐色纤毛状鳞片，中央密，向盖缘鳞片逐渐稀疏，边缘有短条纹；菌盖遇KOH渐变黄色，菌褶白色，薄，直生或稍延生；菌肉白色，具淀粉香味；菌柄长1.4～4.2 cm，直径0.1～0.2 cm，圆柱形，白色至浅灰色，中空，基部膨大呈球形，菌环上位，白色，膜质（图2A、B）。

图2 冠状环柄菇子实体形态及微观结构

孢子（6.7～9.1）µm×（4.3～6.2）µm，[Q1=（1.2～2.6，Q2=1.68±0.37]，楔形或瓜籽形，光滑，无色，非淀粉质，类糊精质（图 2C、D）；担子（19.2～31）µm×（6.0～7.2）µm，棒状，无色，四个小梗，很短，基部具锁状联合；褶侧囊体缺失，褶缘囊体（19.2～39.0）µm×（8.4～12.0）µm，倒梨形或棒状，无色（图2E）。菌盖表皮由胶化菌丝和无色菌丝组成，无色菌丝直径7.2～12µm，分枝，顶端稍膨大，钝圆，具锁状联合；胶化菌丝直径3.6～5µm，黄棕色，少，分枝；菌柄表皮菌丝排列整齐，直径7.2～10.0µm，无色，（图2F、G）。盖表鳞片由长椭圆形、棒状的菌丝细胞首尾相接组成，菌丝直径9～12.0µm，无色，具隔膜，分枝少，末端细胞钝圆（图2H），菌柄表皮由排列整齐的菌丝组成，菌丝直径7～9µm，无色，隔膜均匀，分枝少，排列整齐（图2I）。

该种主要特征为子实体很小，菌盖具红棕色或黄鳞片，遇KOH变黄，菌柄光滑，具有楔形孢子，轻微的类糊精质，菌盖表皮菌丝不成栅栏状，无色，稍膨大，属于环柄菇组 sec.Lepiota[9，12-14]，该种在我国分布广泛，具肠胃性毒素，含有高浓度重金属[10，15]。

研究标本为CFSZ11356，2016年7月31日由田慧敏、柳艳斌采自于内蒙古赤峰市新城区机场路西侧葡萄采摘园地上。

2.1.3 红盖白环菇Leucoagaricus rubrotinctus（Peck）Singer（内蒙古新记录种）

子实体中等大，菌盖直径2～4 cm，初期球形后平展，中央凸起，白色，具暗红褐色纤毛状鳞片，呈辐射状，后期边缘破裂或不破裂呈纵向纤毛状。盖面遇KOH渐变灰绿色，菌肉薄，白色，表皮下带红色。菌褶离生，稍密，不等长，白色。菌柄长约2.5 cm，粗0.2～0.3 cm，圆柱形，基部稍膨大，菌环以上浅米白色，菌环以下浅黄褐色，光滑，内部空心，干后变深。菌环膜质，白色，生菌柄的上部（图3A）。

担孢子（6.5～～9.6）µm×（3.0～5.3）µm，[Q1=（1.5～2.12），Q2=1.98±0.31]近卵圆形、长椭圆形，无色，光滑，类糊精质，在Melzer中变红（图3B、C）。担子（19.0～33.6）µm×（5.3～9.4）µm，棒状，无色，四个小梗（图3D）；褶侧囊状体缺失，褶缘囊体（30～36）µm×（9～12）µm，棒状或倒梨形（图3E）。菌盖表皮由两种菌丝组成，一种是胶化菌丝，直径5～9µm，金黄色，表面光滑，隔膜很少，不分枝，另一种菌丝直径7.7～16.8µm，无色，具颗粒状物，顶端钝圆，稍膨大（图3F）；盖表鳞片由栅栏状排列菌丝组成 ，有 隔 膜 ，末 端 细 胞（67～156）µm ×（14.4～26.4）µm，顶端钝圆，基部狭细，无色，有的具浅棕色色素（图3G），菌柄由排列整齐的无色菌丝组成，有的菌丝顶端稍膨大，直径10.1～14.4µm。

该种主要特点是菌盖密被酒红色、红褐色或橘红色纤毛状附属物，中央色深呈乳头状，边缘色浅，受伤不变色[16]。该种于1882由Peck描述命名Lepiota rubrotincta Peck[17]，1948年Singer将其归入白环菇属（Leucoagaricus），红色组 sec.Rubrotincti[17]，该种为内蒙古新记录种。

研究标本为CFSZ10575，2015年9月6日由田慧敏、柳艳斌等采自于内蒙古赤峰市红山区动物园道边杂草上。

图3 红盖白环菇子实体形态及微观结构

图4 粉褶白环菇子实体形态及微观结构

2.1.4 粉褶白环菇Leucoagaricus leucothites（Vittad.）Wasser=Lepiota leucothites（Vittadini）P.D.Orton

子实体小，菌盖直径2.2～3.6 cm，初钟形或半球形，后平展，白色，中央有浅黄棕色平伏鳞片，干后边缘有条纹，规则开裂。菌肉薄，白色，菌褶直生或弯生，稍密，不等长，白色，干后米黄色。菌柄长2～3 cm，粗0.2～0.3 cm，圆柱形，基部膨大，光滑，浅棕色，内部空心，老后变深至灰棕色。菌环膜质，白色，位于菌柄的上部（图4A）。

图5 球孢青褶伞子实体形态及微观结构

担孢子（6.5～10）µm×（3.6～4.8）µm，[Q1=（1.47～2.2），Q2=1.72±022]，长椭圆形，瓜子形，无色，光滑，类糊精质（图 4B）。担子（19.0～27.6）µm×（5.3～8.4）µm，棒状，无色，四个小梗（图4D），褶侧囊状体缺失，褶缘囊体（14.4～26.4）µm×（7.2～9.6）µm，倒梨形，无色（图4E）。菌盖表皮由无色菌丝组成，具无色颗粒状物，（28.8～40.8）µm×（9.6～13.2）µm（图4F）。菌盖鳞片由无色菌丝首尾相接组成，菌丝直径（9.6～18）µm，长椭圆形（图4C）。菌柄表皮由排列整齐的菌丝组成，菌丝直径7～10µm，隔膜均匀，浅棕色（图4G）。

该种主要特点是子实体纯白色，菌环白色，表面幼时光滑，有时菌盖中央具浅黄棕色或米黄色鳞片，且菌盖中央幼时会龟裂[18-19]。该种幼时与致命毒性的白毒伞Amanita verna相似，但是该种没有菌托，注意区别，在我国分布广泛，具胃肠道反应毒素，疑似有毒，慎食[20-21]。

研究标本为CFSZ11339，2016年7月30日由田慧敏、柳艳斌采自内蒙古赤峰市境内西拉沐沦河北岸巴林桥北草地。

2.1.5 球孢青褶伞Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang（内蒙古特有种）

子实体小到中等。菌盖直径2.3～5.2 cm，半球形，中间凸出，表面白色至污白色，附棕色至红棕色的丛毛状小鳞片，老后易脱落，边缘有微弱的短条纹。干燥时，菌褶密，白色至奶油色，离生，不等长。菌柄长3～5 cm，粗0.3～0.8 cm，圆柱形基部上膨大，白色，受伤不变色，菌环位于菌柄上部，膜质，白色，可移动，易脱落（图5A、B）。菌肉白色，薄，味温和。

担 孢 子（7.5～10.4）µm ×（7.0～9.6）µm，（Q1=1.02～1.25），Q2=1.18±0.05）近球形，宽椭圆形，光滑，透明，厚壁（约0.5µm），有小短柄，易脱落，糊精质（图5D）；担子（29～41）µm×（9.5～12.5）µm，棒状，薄壁，4个孢子，透明，有的基部锁状联合。褶侧囊体无，褶缘囊体（24～36）µm×（8～10）µm，棒状或宽棒状，无色透明，薄壁。菌盖表皮由特化的栅栏状排列的菌丝组成，菌丝末端细胞（74～120）µm×（14.4～24.0）µm，形状各异，棒状、瓶形、腹鼓状，无色。盖表鳞片由栅栏形排列的菌丝组成，菌丝无色，具隔膜，分枝，末端细胞（21.6～31.2）µm×（6～10.1）µm，短棒状或倒梨形。

球孢青褶伞外形与庭院青褶伞Ch.hortense相似，都具有白色菌盖和棕色鳞片，孢子没有芽孔，但是后者担子着生2孢子，孢子椭圆形，菌柄受伤变色。而球孢青褶伞具有球形的孢子，孢子较小，在盖表皮鳞片菌丝末端细胞呈短棒状，顶端稍膨大[22]。分子检索与Ch.lusitanicum相似度较高97%，但是二者形态差异很大，Ch.Lusitanicum子实体呈亚球形，孢子有脐状附属物[23]，该种首次发现于内蒙古[22]，但未见详细描述，后期也没有相关报道，为内蒙古特有种，食毒不明，甚食。

研究标本为CFSZ10555，2015年9月6日由田慧敏、柳艳斌等采自于内蒙古赤峰市红山区动物园道边杂草上。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

2.2.1 四个环柄菇样品的ITS测序结果

四个样品DNA的ITS序列，经检测CFSZ11379长度为704 bp（登录号为MG367257），CFSZ11356为710 bp（登录号为MG367255），CFSZ 10575为698 bp（登录号为MG367253），CFSZ11339为725 bp（登录号为MG367254），CFSZ10555为720 bp。

2.2.2 五个环柄菇样品ITS序列对比结果

将测得的五个标本ITS序列在GenBank数据库进行Blast比对分析，每个标本选择具有较高相似度的序列，共获得30个真菌DNA序列（表1）。

表1 与供试环柄菇5个标本rDNA-ITS序列最相似的物种

2.2.3 系统发育树分析结果

对五个样本CFSZ11339、CFSZ11356、CFSZ11379、CFSZ10575、CFSZ10555的ITS序列及与其高度相似的序列构建系统发育树。结果表明：所有序列一共三大分支，第一支白环菇属（Leucoagaricus），第二支青褶伞属（Chlorophyllum），第三支环柄菇属Lepiota。其中CFSZ 11379与Lepiota brunneoincarnata聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ11379鉴定为肉褐鳞环柄菇L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín，CFSZ11356与 L.cristata聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ11356鉴定为冠状环柄菇Lepiota cristata（Bolton）P.Kumm.，CFSZ10575与La.rubrotinctus（Peck）Singer聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ10575鉴定为红盖白环菇La.rubrotinctus（Peck）Singer，11339 与 La.leucothites聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ 11339 鉴 定为 粉 褶 白 环菇 La.leucothites（Vittad.）Wasser，CFSZ10555 与 Chlorophyllum sphaerosporum聚在一起，结合宏观特征和微观结构将标本CFSZ10575鉴定为球孢青褶伞Chlorophyllum sphaerosporum Z.W.Ge&Zhu L.Yang。

3 小 结

图6 系统发育树

环柄菇类真菌分类复杂，种类多，很多种外形特征极其相似，很多种都有毒，有的种为剧毒，如褐鳞环柄菇（L.helveola Bres.）、酒红环柄菇（L.josserandii Bon&Boiffard）等，误食常会危及生命[10-11，22]。而且该类真菌往往分布在公园、农田、林缘、道边、草地等地，被采食的概率极高，存在潜在的危险。详细介绍了内蒙古境内的四种有毒环柄菇，并进行了鉴定验证，四种菇均有不同程度的毒性，其中肉褐鳞环柄菇 L.brunneoincarnata Chodat&C.Martín为极毒菌，误食后会导致肝肾、呼吸衰竭，死亡率极高，其他三种误食后均表现为胃肠型中毒症状。冠状环柄菇L.cristata（Bolton）P.Kumm.重金属含量高，对人体有害[15]，所以不宜食用。该结果为有毒环柄菇的识别提供方便，为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据。