[Ru（bpy）2dppz]2+的合成及其与DNA的相互作用研究

梁霞霞，周 兵，黄荣富

（成都理工大学材料与化学化工学院，四川 成都 610059）

0 前言

钌配合物是具有丰富的光化学、光物理和电化学等性质，因此，可用作DNA的结构探针。例如，Δ-Ru （phen）32+作为 B-DNA 结构探针， 用于DNA 结构的研究[1]；此外，[Ru（bpy）2dppz]2+和[Ru（phen）2dppz]2+，因具有刚性、共平面的电子共轭体系，与DNA结合力强，能插入DNA碱基对之间[2-4]。同时，[Ru（bpy）2dppz]2+及其衍生配合物作为核酸探针还具有无毒、性质稳定、灵敏度高、选择性好、使用方便等优点。在金属抗癌药物方面，[Ru（bpy）2dppz]2+及其衍生物具有较高的抗肿瘤活性，并将其大量用于临床研究之中[5-7]。荧光光谱是一种光致发光方法，是研究小分子与DNA之间作用方式的方法之一，它是一种比较灵敏的分析方法。 本文通过两步反应合成了[Ru（bpy）2dppz]2+，并分别用紫外-可见吸收光谱法、核磁共振和质谱对Ru-dppz进行结构表征，利用荧光法考察了Ru-dppz与双链DNA（dsDNA）的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

F-4600荧光光谱仪（日立），UV-2700紫外分光光度计 （日本岛津公司），LC/MSD-VL液质联用仪（安捷伦公司）；邻苯二胺、1，10-邻菲罗啉-5，6-二酮、二水合顺-双（2，2’-二吡啶基）二氯化钌（[Ru（bpy）2]Cl2·2H2O）（购自上海阿拉丁）、小牛胸腺DNA（Calbiochem，德国）、其它化学试剂均购自于成都科隆化学试剂公司。所有试剂均属分析纯无需进一步纯化。

1.2 Ru-dppz的合成

分别称取0.4997 g邻苯二胺、0.4998 g 1，10-邻菲罗啉-5，6-二酮置于烧杯中，加入适量乙醇（约30 mL）微热使其完全溶解，将邻苯二胺溶液缓慢加入到 1，10-邻菲罗啉-5，6-二酮溶液中，边加入边搅拌，然后在温水浴中加热至沸腾，保持沸腾5 min；在冰水浴中冷却结晶（红棕色），过滤后再重结晶得到棕黄色针状产物（Dppz）。

称取0.4852 g顺-双（2，2'-二吡啶基）二氯化钌 （II）与上步制备的配体0.2913 g于250 mL锥形瓶中，加入120 mL甲醇和水的混合溶剂（V水∶V甲醇=2∶1）溶解。在恒温磁力搅拌器上恒温加热并搅拌回流4.5 h，得到深红色溶液，保持恒温蒸发至15 mL，加入45 mL蒸馏水，继续煮沸10 min。将溶液在冰水浴中冷却沉淀，过滤沉淀。在滤液中加入10 mL 10%的氟硼酸钠溶液以沉淀合成的[Ru（bpy）2dppz]2+，过滤得到红棕色粗产物[Ru（bpy）2dppz]（BF4）2沉淀。 将所合成的粗产物于30 mL 80%的乙醇中微热溶解，并于水浴中冷却结晶，过滤得深红色粉末状沉淀，以此方法再次重结晶以提纯产物而获得终产物。

2 结果与讨论

2.1 Ru-dppz的合成

Ru-dppz的合成可以通过两步反应制得：首先，1，10-邻菲罗啉-5，6-二酮与邻苯二胺反应制备联吡啶体配合物二吡啶[3，2-a；2'，3'-c]吩嗪（Dppz）；第一步的产物 Dppz再与顺-双（2，2'-二吡啶基）二氯化钌（II）二水合物（Ru （bpy）2Cl2）反应制备二联吡啶二吡啶[3，2-a；2'，3'-c]吩嗪钌（Ru-dppz）。反应方程式如图1所示。

图1 Ru-dppz的合成途径

2.2 Ru-dppz的核磁共振谱（NMR）

首先，将所合成的产物使用核磁共振进行表征，结果如图2所示：δ=8.033～8.313的两组多重峰为 （2，7，10，11，12，13 位质子峰），δ=9.284～9.300 的二重峰为（1，8 位质子峰），δ=9.758～9.778的二重峰为 （3，6 位质子峰），δH（CD3CN），7.28（2H，td，J=1.2，6.4 Hz），7.49（2H，td，J=1.2，6.0 Hz），7.75（2H，d，J=5.2 Hz），7.88（2H，d，J=4.8 Hz），7.91（2H，dd，J=6.0，8.0 Hz），8.04 （2H，td，J=1.2，7.6～8.4 Hz），8.12～8.20（6H，多重重叠），8.50（2H，dd，J=3.6，6.4 Hz），8.56 （4H，dd，J=8.4，13.2 Hz），9.69（2H，dd，J=1.2，8.4 Hz）。 表征结果与文献值一致[8-10]。

2.3 Ru-dppz的紫外-可见吸收光谱图

我们研究了Ru-dppz的紫外-可见吸收光谱，如图（3）所示，Ru-dppz在 281 nm、368 nm、440 nm分别出现3个吸收峰，与所参考文献紫外吸收谱图的吸收峰一致[11]。

图2 Ru-dppz核磁共振氢谱图（溶剂为CD3CN）

此外，我们还利用质谱测得Ru-dppz的质荷比（m/z）为 346，与我们理论计算的[Ru（bpy）2dppz]2+的质荷比一致。综合这三种方法的表征结果，由Ru-dppz的紫外可见光吸收谱图中出现的3个特征吸收峰，核磁共振氢谱图的解析，以及质谱所得其分子量信息，证明成功合成了Ru-dppz。

图3 Ru-dppz的紫外可见吸收光谱图

2.4 Ru-dppz的荧光特性研究

2.4.1 Ru-dppz的“光开关”行为研究

从谱图（图4）可知最大发射波长在615 nm左右，并且荧光强度随着dsDNA的浓度增加而增强。根据荧光性质的研究可以得出结论，本实验合成的产物Ru-dppz具有荧“光开关”分子的性质，即单独的Ru-dppz荧光信号很微弱，当与ds-DNA相互作用以后产生强烈的荧光。

图4 10 μmol/L 的 Ru-dppz（a）在加入 10 μg/mL（b）和 100 μg/mL（c）的 dsDNA 前后的荧光光谱图（激发波长：460 nm）

2.4.2 Ru-dppz与dsDNA的相互作用研究

图5是Ru-dppz与dsDNA的荧光滴定曲线。从图5可以看出，初始阶段荧光强度随着Rudppz浓度的增加而增加，最后趋于饱和达到平台。以荧光强度增加部分拟合一条直线，其斜率为K1=2.8461×108。将拐点处的点分别计算binding值，b=信号/K1，在分别用该拐点Ru-dppz的实际浓度减去binding值，以Free表示。然后以b对b/Free作直线，可以得到一条斜率K2=-6.7953×10-8的直线L2，对K2求负倒数即为Ru-dppz的结合常数。带入斜率K2，计算得到结合常数K=1.5×107L/mol。

图5 不同浓度Ru-dppz与 dsDNA（5.1 μg/mL）相互作用后的荧光谱图（a至m浓度依次为0.430、0.644、0.854、1.064、1.274、1.484、1.694、1.904、2.114、2.324、2.639、3.164、3.689 μmol/L）激发波长：460 nm）。插图为对应的Ru-dppz的浓度信号曲线。

由Ru-dppz的浓度曲线图可以获得在荧光强度达平台后的平均荧光强度为266.2，直线L1与平台的交点所对应的浓度为Ru-dppz与小牛胸腺DNA的最大结合浓度，即将平台信号266.2带入L1计算获得浓度Cmax=1.09×10-6mol/L。且dsDNA的校正浓度按每个碱基对的平均分子量为 325，则换算为碱基的摩尔浓度为C碱基=15.69 μmol/L。则该结合比 CRu-dppz：C碱基=0.07，染料与碱基对之比为0.14，即 7.14个碱基对结合1个Ru-dppz分子。

3 结论

本文通过两步反应合成了 “光开关”分子，Ru-dppz，并通过三种不同的方法表征了本物质的结构。产物的紫外-可见吸收光谱、核磁共振氢谱和质谱表征结果与理论结果一致，说明实验中成功合成Ru-dppz。Ru-dppz与dsDNA相互作用研究表明，Ru-dppz与dsDNA结合后，荧光信号得到恢复。通过荧光滴定实验，测得Ru-dppz与dsDNA的结合常数为1.5×107L/mol，染料与碱基对之间的结合比为0.14。