高效液相色谱法同时测定染发剂中10种苯二胺衍生物

吴光斌， 胡 阳， 倪 辉， 蔡慧农

(集美大学生物工程学院，福建厦门 361021)

苯二胺类染发剂具有染色效果好、色调变化宽、维持时间长等诸多优点，是目前应用最广泛的染发剂，但该类染发剂中所用到的一些染料中间体如p-苯二胺、p-氨基苯酚等具有致敏性和致突变性[1，2]，特别是苯二胺的一些衍生物，可经皮肤吸收，引起皮疹和使肝脏受损害[3，4]。目前染发剂的检测方法主要包括薄层色谱[5]、高效液相色谱(HPLC)[6]、液相色谱-质谱(HPLC-MS)[7]、气相色谱(GC)[8]、气相色谱-质谱(GC-MS)[9]、离子色谱法[10]、毛细管电泳[11]等。由于苯二胺及其衍生物具有强极性、低挥发性及不稳定性的特点，且一种染发剂中往往同时添加了多种苯二胺衍生物，因此，HPLC法是最理想的检测方法。虽然已经有一些研究运用HPLC对单种或几种苯二胺类染料进行了测定，但对染发剂中多种p-苯二胺N位衍生物的分析研究较少。

本实验用HPLC-紫外(UV)检测法同时测定染发剂中m-苯二胺、p-苯二胺盐酸盐、p-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸盐、2-硝基-p-苯二胺、N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N,N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐10种苯二胺衍生物，方法简单、快速、准确，可基本满足实际样品分析要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1525高效液相色谱仪(美国，Waters)，配紫外(UV)检测器；pH211型pH计(意大利,Hanna)；KQ-250E型超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司)；EL104型电子天平(瑞士,Mettler-Toledo)；5415D型离心机(德国,Eppendorf )。

标准物质(纯度≥98%)：m-苯二胺、p-苯二胺盐酸盐、p-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸盐、2-硝基-p-苯二胺、N,N-双(2-羟乙基)-p-苯二胺硫酸盐、N,N-二甲基-p-苯二胺硫酸盐、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、N-苯基-p-苯二胺盐酸盐，均购自日本东京化成公司。标准储备液：准确称取62.5 mg上述10种标准品，各加入25 mg Na2SO3，用50%乙醇水溶液定容至25 mL容量瓶中，混匀，浓度为2.5 g/L，-18 ℃保存一周。混合标准工作溶液：分别移取适量的各单一标准储备液，用50%乙醇水溶液稀释成浓度为0.1、1、5、50、100、200、400 mg/L的混合标准溶液。25 mmol/L磷酸盐缓冲液体系：称取Na2HPO40.958 g、KH2PO43.06 g、辛烷磺酸钠1.0 g溶于约900 mL超纯水中，H3PO4调节pH值至6.0，定容至1 000 mL；1%Na2SO3溶液。乙腈(美国天地公司)、辛烷磺酸钠(美国Sigma公司)均为色谱纯；Na2SO3、Na2HPO4、KH2PO4、乙醇等均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 样品处理

准确称取0.5 g染发剂样品(精确至0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加入约10 mL 50%乙醇水溶液，使样品完全溶解，然后加入1 mL 1%的Na2SO3溶液，用50%乙醇水溶液定容。涡旋混合后超声提取15 min，转移至离心管以4 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜后，进行HPLC检测。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Discovery RP-Amide C16柱(250×4.6 mm，5 μm，美国Supelco公司)；流动相：A相为25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.0,含0.1 %的辛烷磺酸钠)，B相为乙腈；梯度洗脱：0～8 min，5%～40%B；8～15 min，40%～90%B；15～22 min，90%～5%B；22～25 min，5%B。流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：250、280 nm。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

本方法采用50%乙醇水溶液超声波提取，由于苯二胺衍生物中间体极易氧化变质，因此在提取过程中加入还原剂1 mL 1%Na2SO3溶液以提高苯二胺衍生物的回收率。样品无需净化，即采用提取液离心去沉淀并过滤后直接进样，方法简便、快速。

2.2 液相色谱条件的选择

2.2.1色谱柱的选择实验比较了RP Amide C16柱(美国Supelco公司)和ZORBAX Extend C18柱(美国Agilent公司)的分离效果，结果显示RP Amide C16柱对胺类物质有良好的保留能力和分离度。因此实验选用RP Amide C16柱。

2.2.2流动相体系的选择实验研究了不同溶剂、pH值及离子对试剂对分离效果的影响。考察了水-甲醇、水-乙腈、甲醇-磷酸盐缓冲盐(用NaOH调节pH值6.0、6.5、7.0)、乙腈-磷酸盐缓冲液(用NaOH调节pH值6.0、6.5、7.0)、乙腈-磷酸盐缓冲液(用NaOH调节pH值6.0、6.5、7.0，含0.1%的辛烷磺酸钠)5种流动相体系对实验的影响。结果表明：采用乙腈作为有机相较甲醇能获得较好的峰形及保留；采用pH值为6.0的磷酸盐缓冲液做流动相时，各目标物的分离效果最好；采用辛烷磺酸钠的离子对试剂可以明显改善保留和峰形。因此实验最终选择乙腈-磷酸盐缓冲液(用NaOH调节pH值6.0，含0.1%的辛烷磺酸钠)作为最佳流动相。 等度洗脱难以将10种目标物与样品中的其它染料成分有效分离。因此采用梯度洗脱，优化的流动相梯度洗脱如1.3节所述。

2.2.3检测波长的选择对10种目标物进行紫外区光谱扫描，除N-苯基-p-苯二胺盐酸盐在280 nm有特征吸收外，其它成分在250 nm左右区域都有吸收峰，因此实验选用250 nm和280 nm作为定量检测波长。

2.2.4柱温的选择实验选择25 ℃作为色谱柱温度，保证了保留时间的稳定性，同时也避免温度过高引起染料成分的变化。

在上述优化的液相色谱条件下，10种目标物标准品的典型色谱图见图1。

图1 10种苯二胺衍生物标准品的色谱图

2.3 标准曲线、线性范围和检出限

在优化实验条件下，对不同质量浓度的10种目标物标准品进行测定，结果显示，10种目标物的质量浓度在0.1～400 mg/L范围内与响应值呈良好的线性关系，相关系数r为0.9992～0.9999。分别以信噪比(S/N)=3和S/N=10计算方法的检出限和定量限(表1)。完全满足国家标准[12]对染发剂的检测要求。

2.4 回收率与精密度

选择染发剂样品(10种苯二胺衍生物均未检出)，在所确定的定量限基础上添加3个不同浓度水平的标准品，进行加标回收率实验，平行测定6次，计算其回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明，10种苯二胺衍生物的加标回收率为86%～115%，RSD均小于10%，说明该检测方法的准确度好、精密度均较好。

表1 10种苯二胺衍生物的标准曲线、相关系数、检出限和定量限

2.5 实际样品的测定

利用本方法测定了5种市售染发剂中10种苯二胺衍生物的含量。结果表明所测染发剂样品中各种苯二胺衍生物成分的含量符合我国《化妆品卫生标准》，未发现含量超标情况。

3 结论

建立了染发剂中10种苯二胺衍生物的高效液相色谱检测方法，该方法样品前处理操作简便、快速、准确、精密度好、回收率高、为染发剂的监督检测提供了良好的技术支持，也是《化妆品卫生规范》(2007年版)中检测方法的良好补充。

致谢：欧光南老师对本论文及实验给予了大力帮助，在此表示感谢！