UPLC-MS/MS法快速测定奶粉中17种喹诺酮类药物

谢瑞龙，段国霞，莫楠，李翠枝，刘丽君，张立佳，胡雪

(内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特010110)

0 引 言

喹诺酮类药物是一类人工合成的抗菌药物，已经被广泛的用于动物的疾病治疗与预防中[1]。这些药物如果不正确的使用会导致在动物源性食品中的残留，从而影响到人类的健康[2]。因此，世界多个国家规定了其在动物源食品中的最大残留限量[3-4]。我国农业部235公告中也规定相关喹诺酮在乳中的最大残留限量[5]：例如达氟沙星不得超过30μg/kg，氟甲喹不得超过50μg/kg以及恩诺沙星与环丙沙星两者之和的最大残留限量为100μg/kg。

目前，喹诺酮类药物的检测方法[6-9]主要有高效液相-串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫法、胶体金快速检测法等。高效液相色谱串联质谱法具有简单、高效、灵敏度高等特点，是研究喹诺酮类药物残留常用的检测方法。此外，新的前处理方法[10-12]能减少较为繁琐的前处理步骤，使整个前处理更加简单、高效。例如不少科研工作者利用新颖的固相萃取柱Oasis Prime HLB[11-12]，可以减少活化、平衡、洗脱等步骤，实现了牛奶、肉类等动物源食品中兽物残留的快速检测，这为本研究开展检测奶粉中喹诺酮类药物检测提供了思路。然而在采用Oasis Prime HLB进行快速前处理过程中，试验发现由于受到奶粉高脂肪含量的影响，提取液提取时容易出现结块现象或离心后有明显的油脂层。因此，现有的前处理方法无法应用到高脂肪奶粉基质中，需要进行优化。本工作拟利用新颖的固相萃取柱Oasis Prime HLB，建立一种适用于不同脂肪含量奶粉，同时测定17种喹诺酮类药物的简单快速超高效液相色谱质谱联用（UPLC-MS/MS）法。这为喹诺酮在奶粉中的检测提供一种选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同脂肪含量的奶粉：高脂肪奶粉（脂肪含量为27.9%），中等脂肪奶粉（脂肪含量为13.5%），低脂肪奶粉（脂肪含量为1.2%）。

17种喹诺酮类药物标准品纯度均大于97%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈（色谱纯），德国Merck公司；甲醇（色谱纯），德国Merck公司；甲酸（色谱纯），美国Merck公司。

1.2 仪器与设备

低温高速离心机，德国SIGMA公司；超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配有电喷雾离子源），Oasis Prime HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），美国Waters公司；振荡仪，Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理

称取0.30 g奶粉样品于30 mL聚四氟乙烯离心管中，加入1 mL超纯水混匀。加入8.0 mL 0.1%甲酸甲醇-乙腈（体积比1∶7）充分振荡混匀后，继续涡旋振荡10 min。10 000 r/min离心5 min，将一半上清液直接转移至Oasis Prime HLB固相萃取柱（无需活化和平衡）中，收集全部流出液，40℃氮气吹干。1 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈（体积比90∶10）复溶，漩涡震荡，过0.20μm滤膜，供上机分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱，100 mm×2.1 mm(i.d.)，1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.45 mL/min；线性梯度洗脱条件：0～1.0 min，90%A；1.0～6.0 min，90%～50%A；6.0～8.0 min，50%～5%A；8.0～10.0 min，5%A；10.0～12.0 min 90%A。

1.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子模式（ESI+）；毛细管电压：3.17 k V；源温：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量：1 000 L/Hr；碰撞室气流量：0.17 mL/min。多反应监测方式（MRM）检测。

1.4 结果计算

所有化合物均采用外标法定量。每种喹诺酮类药物残留量按式（1）计算：

该方程式式中，Xi为试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；ci为从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V为样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m为样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。

2 结果与分析

2.1 前处理方法选择

参考Oasis Prime HLB快速前处理牛奶基质的方法[11]，进行奶粉中喹诺酮类药物残留的检测。当进行一些脂肪含量高的婴儿配方奶粉前处理试验时，发现其前处理条件不满足要求：用0.2%甲酸乙腈提取过程中，提取物成黏稠状，并伴随有结块现象，提取效果不理想；离心后上清液底部会出现明显的油脂层现象，油脂层会造成固相萃取柱堵塞，若加压容易导致油脂与有机溶液共流出。为了排除是产品特例现象，本研究对不同品牌的高脂肪含量的奶粉以4 mL 0.2%甲酸乙腈作为提取液进行了前处理，均存在上述现象（如表1）。因此本研究对其前处理条件进行优化，以达到能同时满足不同脂肪含量奶粉的要求。

表1 4种不同婴儿配方奶粉的前处理试验现象

本方法对提取液体积和提取液组分进行优化：经过多组试验发现，当提取液体积由4 mL增加至8 mL时，离心后，上清液底物的油脂层消失，有利于过固相萃取柱。选取混合组分时，在乙腈溶剂提取液中，增加甲醇溶剂的量和减少甲酸含量，可以避免奶粉振荡过程中的结块现象。在解决完提取过程和离心过程遇到的问题后，本实验考查了不同混合提取液对喹诺酮类药物提取效率的影响，包括甲醇-乙腈（体积比1∶7，提取液1）、甲醇-乙腈（体积比2：6，提取液2）、0.1%甲酸甲醇-乙腈（体积比1∶7，提取液3）、0.1%甲酸甲醇-乙腈（体积比2∶6，提取液4）。回收率数据结果，如图1显示，提取液1和2的回收率范围分别为51.6%～84.2%和44.2%～81.7%，回收率值偏低，提取液3和4的回收率范围分别为回收率79.9～94.3%和68.1～89.5%，回收率明显优于提取液1和2，说明在含有甲酸的提取液有利于提取效果。此外，采用提取液3方案时，回收率整体优于提取液4。因此，最终选取0.1%甲酸甲醇-乙腈（体积比1∶7）作为提取液。

图1 不同提取液对17种喹诺酮回收率的影响

2.2 上机条件选择

对已报道的文献调研，目前报道的喹诺酮类药物残留检测方法[11-15]已对色谱柱以及流动相的选择进行了优化，因此本研究参考文献的条件[11,15]，色谱柱选用Waters BEH C18，流动相选择乙腈-0.1%甲酸溶液，采用梯度洗脱的方式，能有效地分离17种目标化合物。此外，系列化合物的保留时间、定量离子对、定性离子对、锥孔电压以及碰撞电压见表2。

表2 17种喹诺酮类药物的质谱条件

2.3 基质效应和标准曲线

本试验考察了不同脂肪含量的奶粉基质效应。用每种空白基质加复溶液配制5μg/L的标准工作液与用前处理复溶液配制的5μg/L标准工作液进行比较，求两者峰面积的比值，大于100%为基质增强作用，反之则为基质抑制作用。每组样品重复条件下做5次，取平均值[17]。基质效应结果显示，高脂肪含量（27.9%）的奶粉基质效应为62.5%～99.4%，中等脂肪含量（13.5%）的奶粉基质效应为57.4%～130.2%，低脂肪含量（1.2%）的奶粉基质效应为61.7%～113.4%。其中3种不同脂肪含量奶粉对培氟沙星化合物表现出明显的基质抑制的作用，分别是62.5%，57.4%和61.7%；中等脂肪含量和低脂肪含量的奶粉对达氟沙星有明显的基质增强效应，分别是130.2%和113.4%；3种奶粉样品对于其他化合物有不同程度的基质抑制作用。因此，本研究采用空白基质配制标准曲线进行定量。

17种喹诺酮类兽药的准曲线和线性关系如表3所示。由表3可以看出，17种物质的浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9900，其中低脂肪含量奶粉样品的相关系数均大于0.9950。在奶粉中17种喹诺酮类化合物的定量限为3.0μg/kg，其信噪比（S/N）均满足≥10的要求。

2.4 回收率与精密度试验

本研究选择具有代表性的，3种不同脂肪含量的基质样品进行回收率试验：每个添加水平均进行6次平行试验，依次测定3μg/kg（定量限）、30μg/kg以及60 μg/kg 3个不同浓度的加标回收率。试验数据见表3。

表3 标准曲线、回收率及相对标准偏差(RSD)试验数据

由表3可知，在高脂肪奶粉样品中，17种喹诺酮类药物的加标回收率为70.0%～99.7%，相对标准偏差为1.8%～8.9%；在中等脂肪奶粉样品中，17种喹诺酮类药物的加标回收率为65.3%～104.8%，相对标准偏差为2.1%～8.0%；在低脂肪奶粉样品中，17种喹诺酮类药物的加标回收率为66.7%～100%，相对标准偏差为0.6%～6.7%。所有结果说明该方法适用于不同脂肪含量的奶粉中不同浓度的喹诺酮类药物残留的测定，均表现出较好的回收率和精密度。

3 结论

本文提供了一种适用于不同脂肪含量奶粉基质中17种喹诺酮类药物残留的UPLC-MS/MS检测方法。本研究采用了Oasis Prime HLB固相萃取柱，能简化前处理过程；重点对试验前处理进行了研究，选取0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶剂提取时，效果最优；同时考查了不同脂肪含量样品的基质效应，采用基质空白配制标准曲线，以保证该方法的可靠性。喹诺酮类药物的定量限为3.0μg/kg。当其添加范围为3.0～60μg/kg时，其准确度和精密度均符合国标要求。总体而言，该方法具有简单方便、快速高效的特点，适用于不同脂肪含量奶粉产品的检测。