地皮菜提取液的抗氧化性及抑菌作用研究

王迎进，解晶晶，孙幸，姚聪，连舒婷，李海平

（忻州师范学院化学系，山西忻州034000）

地皮菜（Nostoc commune Vauch）又称地木耳、地软、地耳、地衣等，为念珠藻属植物，主要分布在石灰石区和碦斯特岩溶地带[1]。地皮菜中含有丰富的蛋白质、粗脂肪、粗纤维、总糖、矿物质、维生素、氨基酸、蓝藻素、多糖、钙、磷、铁等各种元素、营养和药用成分，具有很高的营养价值和开发利用前景[2]。据中国药典记载，地皮菜对补充维生素、蛋白质、清热解毒、滋阴润肺、益气明目、皮疹赤热等具有明显滋补食疗效果[3]。目前有关地皮菜的提取工艺的报道较多，而有关地皮菜功能成分的研究报道较少[4]。本试验对地皮菜提取液的抗氧化能力、还原能力以及抑菌作用做了一个较为系统的研究，旨在为地皮菜的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地皮菜：山西忻州农贸市场；氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium chloride，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、还原型辅酶 1（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）：Sigma 公司；试剂均为分析纯。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、LB 培养基：忻州师范学院微生物实验室提供。

1.2 仪器

紫外-可见分光光度计（UV-1800）：上海美谱达仪器有限公司；超声波清洗器（KQ-400KDE）：昆山市超声仪器有限公司；超净工作台（SW-CJ-2F）：苏州净化设备有限公司；全自动高压蒸汽灭菌锅（D-1）：上海乔跃电子有限公司；恒温恒湿生化培养箱（HWS-150）：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 地皮菜活性成分的提取

地皮菜水洗，烘干、粉碎、过筛60 目筛。称取5.000 g 地皮菜粉末4 份分别置于300 mL 锥形瓶中，分别加入100 mL 的蒸馏水、40 %乙醇、70 %乙醇和无水乙醇，在65 ℃下超声辅助提取30 min，超声功率为320 W。冷却离心，导出上清液，将滤渣重复提取2 次。合并滤液，抽滤，浓缩至200 mL，用提取剂定容至250 mL。

1.3.2 抗氧化能力测定

1.3.2.1 羟基自由基清除能力测定

向比色管中加入0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40、2.70、3.00mL 的地皮菜提取液，加蒸馏水至 3.00 mL，依次加 6 mmol/L FeSO4溶液 2.00 mL，2.4 mmol/L 的H2O2溶液 2.00 mL，摇匀，静置 10 min，加入 6 mmol/L水杨酸溶液 2.00 mL，摇匀，37 ℃水浴30 min，离心（3 000 r/min）10 min。取上清液于520 nm 测吸光度（Ai），以蒸馏水代替水杨酸做参比调零（Aj）。以蒸馏水代替样品液做空白对照（A0），平行测定3 次[5]。

羟基自由基清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100

1.3.2.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

吸取 1.00 mL 150 μmol/LNBT，1.00 mL 60 μmol/L PMS 于比色管中，分别加入 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL 样品液，补加蒸馏水至 4.00 mL，混匀，加入 1.00 mL 468 μmol/L NADH（由16 mmol/L Tris-HCl 在pH 8 时配制而成）。于 560 nm处测定样品吸光度（Ai），以蒸馏水代替PMS 溶液做参比参比调零（Aj）。以蒸馏水代替样品液做样品空白对照（A0），平行测定 3 次[6]。

超氧阴离子自由基清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100

1.3.2.3 DPPH·清除能力测定

向比色管中分别加入 0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40、2.70、3.00 mL 提取液，用蒸馏水补至3.00 mL，混匀，加入 2.00 mL 浓度为 2×10-4mol/L DPPH·溶液，放置30 min，于517 nm 处测定其吸光度（Ai），以无水乙醇代替DPPH·溶液做参比调零（Aj）。以无水乙醇代替地皮菜提取液做样品空白对照（A0），平行测定 3 次[7]。

DPPH·的清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2.4 ABTS+·总抗氧化能力测定

将 5.00 mL 7 mmol/L 的 ABTS 和 88 μL 140 mmol/L的过硫酸钾混合，在25 ℃、避光的条件下静置过夜，形成ABTS+·储备液，使用前用无水乙醇稀释成工作液。在734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。吸取 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mL 地皮菜提取液于比色管中，加蒸馏水至0.40 mL。加入2.00 mL ABTS+·，振荡30 s，25 ℃下静置6 min。在734 nm波长处测定地皮菜提取液样品的吸光度值（Ai），以80%乙醇溶液代替ABTS+·溶液做参比调零（Aj）。以蒸馏水代替样品液做样品空白对照（A0），平行测定3 次[8]。

ABTS+·总抗氧化能力的清除率S/%=1-[（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2.5 还原性测定

分 别 吸 取 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL 的地皮菜提取液于比色管中，加蒸馏水至 2.00 mL。加入 2.50 mL 10 g/L K3Fe（CN）6，2.50 mL 0.2 mol/L（pH 6.6）的磷酸盐缓冲溶液，混匀。50 ℃水浴反应20 min。再加入2.50 mL 100 g/L 三氯乙酸。离心10 min，取5.00 mL 上层溶液，加5.00 mL 蒸馏水，1.00 mL 1 g/L FeCl3。在 700 nm 波长处测定吸光度[9]。1.3.3 抑菌作用

1.3.3.1 菌悬液的及含菌平板制备

将供试菌种分别用无水乙醇制成均匀菌悬液（约1011cfu/L）。将融化后的灭菌培养基倾入培养皿中，凝固后加入0.2 mL 菌悬液，用无菌布环涂均匀。37 ℃培养24 h，备用。

1.3.3.2 抑菌效果的测定

用打孔器在培养基上打4 个孔（呈十字形），各孔中心距离相距25 mm 以上，无菌条件下用移液枪将不同提取液注射到孔中，将接种培养皿放入37 ℃恒温箱中培养 24 h，测定菌圈直径（mm）[10-13]。

2 结果与分析

2.1 地皮菜提取液对羟基自由基清除作用

·OH 是目前所知活性氧中对生物体毒性最强，危害最大的一种自由基，可与生物体内多种分子作用，造成糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质氧化损伤，使细胞坏死或突变[14-16]。因此·OH 清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标。地皮菜提取液清除羟基自由基能力见图1。

图1 地皮菜提取液清除羟基自由基能力Fig.1 Scavening rates of the extracts from Nostoc commune Vauch on·OH

如图1 所示，4 种提取液对·OH 均具有较好的清除作用，随提取液用量的增加清除率逐渐增大。其中水提取液清除·OH 的能力明显高于其它3 种提取液。当提取液用量为3.00 mL 时，水提液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液、无水乙醇提取液的清除率分别为：62.63%、55.26%、53.55%、47.38%。

2.2 地皮菜提取液对超氧阴离子自由基清除作用

O2-·是人体内产生的活性氧自由基，能引发体内脂质过碱化，加快机体衰老过程，严重危害人体健康。地皮菜提取液对O2-·的清除作用如图2 所示。

图2 地皮菜提取液清除超氧阴离子自由基能力Fig.2 Scavening rates of the extracts from Nostoc Commune Vauch on O2-·

水提液对O2-·的清除作用最好，无水乙醇提取液最差。O2-·的清除作用随提取液用量的增加逐渐增大，随着提取液乙醇浓度的增加逐渐减小。当提取液用量为2.00 mL 时，水提液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液和无水乙醇提取液的清除率分别为：93.45 %、68.78%、50.95%和20.57%。

2.3 地皮菜提取液对DPPH·的清除作用

DPPH·是一种以氮为中心的稳定自由基，在517 nm波长处有强吸收，当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子数配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子成定量关系[17-18]。地皮菜提取液清除DPPH·能力见图3。

图3 地皮菜提取液清除DPPH·能力Fig.3 Scavening rates of the extracts from Nostoc commune Vauch on DPPH·

由图3 可知，4 种地皮菜提取液都具有不同程度的清除DPPH·能力，且清除能力与提取液用量呈正相关。当提取液用量较小时，4 种提取液清除能力接近。但随着提取液用量的增加，水提取液和40%乙醇提取液清除DPPH·能力显著增加，明显优于70%乙醇和无水乙醇提取液。当提取液用量为3.00 mL 时，水提取液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液和无水乙醇提取液对DPPH·的清除率分别为：96.73 %、87.52 %、72.07%、52.23%。

2.4 地皮菜提取液对ABTS+·抗氧化能力

ABTS 在氧化剂作用下可以被氧化成绿色ABTS+·，抗氧化物存在时ABTS+·的产生会被抑制。可以通过测定734 nm 处吸光度来评价样品的总抗氧化能力[19]。4 种地皮菜提取液对ABTS+·抗氧化能力如图4 所示。

图4 地皮菜提取液总抗氧化能力的测定Fig.4 The scavening rates of extracts from Nostoc commune Vauch on ABTS+·

由图4 可知，随着提取液用量的增加，提取液的总抗氧化能力不断增强。其中，水提液的清除能力最强，40%乙醇和70%乙醇提取液清除ABTS+·能力接近，均明显高于无水乙醇提取液。当提取液用量为0.40 mL时，水提液、40 %乙醇提取液、70 %乙醇提取液和无水乙醇提取液对ABTS+·的清除率分别为：92.09 %、80.84%、83.30%、24.87%。

2.5 地皮菜提取液还原能力的测定

地皮菜提取液还原能力如图5 所示。

图5 地皮菜提取液的还原能力Fig.5 The reducing capacity of extracts from Nostoc commune Vauch

地皮菜提取液均具有一定还原性。其中水提取液、40 %无水乙醇提取液和70 %无水乙醇提取液的还原能力比较接近，明显高于无水乙醇提取液的还原能力较低。随着提取液用量的增大，其还原性也随之增强[20]。

2.6 抑菌作用

选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为试验菌种，对地皮菜提取液的抑菌作用进行评价，对抑菌圈直径测量后进行统计分析如表1 所示。

表1 地皮菜提取液的抑菌作用Table 1 The bacteriostatic action of extracts from Nostoc commune Vauch

由表1 可知，4 种提取液对3 种菌种都有不同程度的抑制作用。其中，水提液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，其抑菌圈直径分别为（0.02±0.41）mm 和（2.51±0.32）mm。无水乙醇提取液对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌圈的直径为（17.53±0.33）mm。

3 结论

地皮菜不同提取液均具有明显的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH·和ABTS+·作用和还原能力。其清除作用和还原能力与提取液用量呈正相关。地皮菜水提取液清除4 种自由基作用和还原能力最强，无水乙醇提取液的清除作用和还原能力最弱。抑菌作用分析表明地皮菜水提液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的具有良好的抑制作用，而无水乙醇提取液对大肠杆菌的抑制作用最强。